甲状腺激素在调节生长、新陈代谢、蛋白质合成和大脑发育等生物过程中起着关键作用。具体而言,3,3',5,5'-四碘-L-甲状腺素(甲状腺酮或T4)和3,3',5-三碘-L-甲状腺激素(T3)对正常生理功能的发育和维持至关重要[1]。对于临床实验室而言,总T4和总T3的测量,以及游离T4(FT4)和游离T3(FT3)的估算,对于甲状腺疾病的诊断和监测非常重要。大多数临床实验室使用免疫测定法测量甲状腺激素。基于免疫分析的方法提供了相对快速、高患者样本吞吐量,有助于实现自动化,但由于分析干扰的问题而严重受损,并且由于蛋白质水平的变化而变得复杂,从而改变了游离激素的可用性[1,2]。这些缺点导致免疫分析不准确,并可能导致虚假的高或低结果[3]。


据报道,液相色谱-质谱法(LC/MS)在测定生物基质(如血清和组织)中的甲状腺激素方面具有比免疫分析更高的特异性和速度[1-3]。然而,所报告的样品制备程序(通常是液-液萃取,然后是固相萃取(SPE))涉及多个耗时的步骤,与自动化不太兼容[3,4]。本工作证明,利用在线SPE和LC/MS快速测定生物基质中的T4、T3和3,3′,5′-三碘-L-甲状腺素(rT3)是成功的。方法开发过程包括使用两种在线SPE筒化学试剂:C8和RP-Amide。血清样本经过蛋白质沉淀程序以释放蛋白质结合的甲状腺激素。通过使用更高浓度的有机溶剂和串联质谱检测将滤筒直接洗涤到分析HPLC柱中,确认在线SPE滤筒上的分析物捕获。


实验性:

材料:SupelTMGenie C8和RP-Amide(RPA)在线药筒(2 cm长x 4.0 mm内径)、人血清(MilliporeSigma Cat.H-1388)、蛋白质破碎溶剂:甲醇和1%(w/v)甲酸铵。


样品处理程序:加入分析物的人血清是以1:3的比例与破碎溶剂涡旋混合沉淀的蛋白质。然后将混合物以10000 x g离心3 min,收集所得上清液并直接注入LC/MS分析。

在线SPE-LC/MS设置

如图2所示,在线SPE-LC/MS装置由一个6端口切换阀和两个泵组成;一个用于装载和清洗样品,另一个用于样品洗脱。为了最大限度地减少药筒的潜在展宽,样品装载/清洗和后续洗脱的流动方向相反。


在线SPE-LC/MS:

仪器:岛津LCMS-8030,带2DLC设置

HPLC柱:Ascentis Express联苯10 cm x 2.1 mm(MilliporeSigma Cat#64065-U)

流动相:(A)水;(B) 甲醇,每种含0.1%乙酸

均衡:70%B%持续10分钟

流量:0.3 mL/min

柱温:35ºC

样品装载/清洗:0.3 mL/min,持续2分钟,然后阀门切换至与HPLC柱串联,在装载样品之前,将药筒与装载溶剂平衡2.5分钟。

进样溶剂:10%甲醇

进样量:2µL进样

检测:MS、ESI()、MRM模式


结果和讨论:

The conventional (off-line) sample preparation by SPE typically involves multiple labour-intensive and time-consuming steps, including: conditioning, sample loading, washing, elution, and finally evaporation and reconstitution of the sample in mobile phase. The on-line cartridges were developed to automate the sample preparation process, minimise hands on time and human error, and reduce overall sample processing time. The present work utilised the C8 and RPA on-line cartridges with LC/MS for the detection of thyroids from in human serum with C8 and RPA on-line cartridges, respectively. The human serum samples were simply protein precipitated with methanol containing ammonium formate and then directly injected for on-line SPE and LC/MS analysis. The sample loading/washing were carried out entirely by the instrument, without any hands-on effort. Additionally, the time-consuming solvent evaporation and reconstitution steps were eliminated. As can been seen from Figures 3 and 4, both C8 and RPA were capable of capturing a trace amount (100 ng/mL x 2 µL in this case) of thyroids from complicated human serum. All three thyroids are resolved from each other, with a peak width at half height <6s and tailing factor from 1.4-1.8. These indicate sharp and nice peak shapes with the on-line cartridges. The total run time is within 6 min.

表1和表2显示了分别带有C8和RPA药筒的在线SPE-LC/MS在连续120次注射脏人血清样本时的坚固性。可以看出,含C8或RPA的甲状腺分析物的保留时间具有很好的重现性,RSD为0.1%-0.2。使用C8和RPA卡式瓶的甲状腺分析物峰面积的再现性(RSD%)分别为6.2-7.0%和5.1%-7.7%,表明具有很好的再现性。


比较两种在线墨盒,与C8墨盒相比,RPA似乎为所有三种甲状腺分析物提供了更大的信号(峰高和面积)。RPA相具有酰胺基团,这些酰胺基团可以形成氢键,并且可以通过氢键相互作用为分析物提供更好的保留。尽管无论使用RPA或C8 SPE筒,分析柱上甲状腺激素的保留时间和峰宽都非常相似,但使用RPA SPE对于直接注射蛋白质沉淀血清样品的分析物保留似乎有轻微的优势。


总结

开发了一种在线SPE-LC/MS方法,用于快速检测人血清中的甲状腺激素,只需最少的动手操作和耗时的步骤。C8和RP-Amide在线药盒均能从蛋白沉淀的人类血清样本中捕获微量甲状腺。所有三种甲状腺分析物T3、rT3和T4均在联苯柱上进行解析,具有尖锐对称的峰形状。此外,使用C8或RPA在线药筒,连续120次注射后甲状腺保留时间的再现性(RSD%)在0.1%至0.2%之间,而峰面积再现性(RSA%)在5.1%至7.7%之间。这些RSD表明在线SPE-LC/MS系统具有很强的稳定性。


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