排除（U）HPLC中保留时间变化的故障——一种系统方法

由于飞行前或飞行中职责中技术内容的数量和细节，飞行准备飞行员采用严格的系统方法，使用详细的检查表。人们的生命取决于它。

同样，建立（U）HPLC分析也是非常技术性的，人们的生活可能取决于分析结果。那么，为什么分析师对检查表不那么勤勉呢？标准操作程序（SOP）是检查表的一种形式，但很少以与飞行员膝盖检查表相同的勤勉方式使用。实际上，大多数商业航空公司的飞行员都使用电子平板电脑作为检查清单，只有为每个行项目选择一个响应，他们才能继续进行程序和下一个检查项目。

也许这为分离科学指明了一个可能的方向和分析世界？

一个非常有用的检查表是一种与排除高效液相色谱保留时间不可重复性相关的系统方法，可以按照上述方式遵循。

HPLC分离问题诊断

1.测量所有感兴趣峰值的保留时间变化率：

保留时间保留时间原始色谱图

Change Ratio (RTR) = Retention Time Problem Chromatogram

2.所有峰值的RTR是否恒定？

a） 是–问题可能是流速问题

b） 趋势（RTR值越来越大或越来越小）–问题可能与%b溶剂或温度变化有关

c） 无趋势（RTR值随机变化）-选择性变化表明pH值、洗脱溶剂或固定相问题（变化）

这是一个非常简单的检查表，大多数分析师在评估麻烦数据时都会在不知不觉中在脑海中处理它，即使RTR值没有计算出来，但在保留时间发生变化时，它有助于诊断问题的原因。

我们可以运行其他几个“检查”来生成验证数据。

溶剂空隙扰动可用于检查和确认是否发生洗脱或流速效应，如以下示例所示。

3.序列分析的空白标记是否重叠或不同？

示例1：分析物保留时间变化和空隙基线干扰也发生变化-问题可能是流速/洗脱液输送问题。

示例2：分析物保留时间发生变化，但空隙基线干扰叠加良好-问题可能与%B溶剂、温度或选择性变化有关。

使用原始色谱图和问题色谱图中感兴趣峰的峰面积比（PAR）和峰高比（PHR）进行评估测试，以进一步确认我们的诊断。

4.PAR如何变化？

Peak Area Change Ratio (PAR) = Peak Area Original Chromatogram

峰面积问题色谱图

a） 所有比率均按恒定比例变化–怀疑存在流速问题或喷油器再现性问题。当然，在排除保留时间问题时，首先要考虑的是流速。

b） 无变化–怀疑%b溶剂或温度有问题

c） 随机变化-怀疑pH值、洗脱液或固定相化学发生变化。由于某些类别的分析物在仪器内的活性内表面上的吸附，可能会发生这些随机面积比变化，然而，只有在检查洗脱液pH值、洗脱液和固定相化学的明显变量后，才应考虑这一点。

5.PHR如何变化？

Peak Height Change Ratio (PHR) = Peak Height Original Chromatogram

峰高问题色谱图

a） 无变化–怀疑存在流速问题

流量减少5%。导致保留和峰面积变化-峰高比（PHR）保持不变。

b） 所有比率增加或减少，但以不可预测的模式–怀疑%b溶剂或温度有问题

%B溶剂保留率降低3%，导致峰高变化不一致。

c） 随机变化-怀疑pH值/洗脱液或固定相化学发生变化

流动相组成（选择性）的变化导致保留时间、峰面积和峰高的随机变化。

5.以下是一些示例以进一步说明

解释其中一些变化；

为什么流量减少时面积增加（例如）？

随着流速变慢，分析物通过检测器流动池的速度变慢，收集的数据点越多，峰面积越大。应检查绝对峰面积，因为峰面积比的任何测定都可能保持不变。

为什么流量变化时峰值高度不变？

对于浓度敏感检测器（吸光度、荧光），检测器中分析物的浓度不会改变，因此峰高不会改变。需要注意的是，如果流速的变化显著影响色谱效率，那么由于峰高与峰宽成反比，峰宽的任何减小（由于效率的增加）都将导致峰高的增加，反之亦然。