阳离子交换色谱(CEX)是一种非变性技术,用于分离和分离蛋白质电荷变体,然后通过MS进行表征。这通常是一个两步过程,其中,特定电荷变化值必须在通过质谱表征之前隔离,因为在CEX中,大多数使用的是非挥发性缓冲液,这与MS不兼容。


MS与CEX的耦合将节省时间,并排除长期隔离过程中可能出现的人为因素。此外,在这两步方法中,可以忽略不显示独特UV峰的次要物种,例如单克隆抗体(MAb)。


SCX与超灵敏MS的直接耦合

在这个申请说明根据Yan等人的研究,将高分辨率SCX(强阳离子交换色谱)直接耦合到超灵敏在线天然MS [1]使用基于MS兼容缓冲系统的pH和盐梯度组合。 雅马哈的BioPro IEX SF是一种无孔强阳离子交换柱,用于NIST单克隆抗体的表征。


优化流动相和梯度

对流动相组成和梯度进行了优化,通过改变pH值和盐浓度,使MAbs保持在其自然状态的范围内,从而实现电荷变体的有效分离。


使用柱后分离器,以便在分析刻度上进行分离的同时进行纳米喷雾电离,理想流速为0.4 mL/min。


MAb电荷变体的分离

此处显示了等电点(pI)为9.2的NIST单克隆抗体及其变体的分离。此外,还分析了另外五种pIs在6.3和9.2之间的内部MAb(未显示)。保留时间通常与MAbs的pI相关。几个pI为8或更高的抗体在pH值低于7.4的条件下洗脱,但每个MAb的保留时间不同。所有单克隆抗体均显示出良好的电荷变体色谱分离。通过使用YMC的BioPro IEX SF的SCX-MS方法,可以检测和测量所有六种MAb中低于1%水平的微小电荷变异物种。