人体肝组织代谢组学分析的多平台方法

代谢组学通过对数千个小分子的系统评估，提供了表征复杂疾病的机会。具体来说，分析肝组织中的代谢物是研究原位修饰和直接在细胞水平强调异常生化途径的合适方法。

考虑到迄今为止，人类代谢组数据库中已包含40000多个代谢物，还有更多尚不清楚，整个代谢组的鉴定仍然是一个巨大的挑战。众所周知，单一的分析技术不足以表征生物隔间中存在的高化学多样性和不同浓度范围的代谢物（例如，在血清中跨越近11个数量级）。因此，多平台方法已成为提高代谢物覆盖率的强制性策略。在本文中，我们介绍了三种互补平台的使用：GC-TOF-MS、GCxGC-TOF-MS和LC-QTOF-MS，这将增加肝组织代谢组特征的代谢物覆盖率。

代谢组学是指对生物系统中所有低分子量代谢物的研究[1]。由于代谢组学能够揭示多种环境刺激与遗传之间的关系，它已成为系统生物学中的一个有用工具。事实上，复杂疾病表型的特征化可以帮助我们识别特定生理反应的新生物标记物，并阐明癌症等复杂疾病的病理生理学。

在过去十年中，分析技术的改进提高了基于质谱的平台的灵敏度、准确性和分辨率，为检测更多化学物种提供了可能。这些进展，再加上不同化学计量学工具的建立，使得有可能从产生的大量数据中提取隐藏的复杂生物信息。尽管生物样品中代谢组的大部分仍然未知，但通常使用补充平台（例如GC-MS和LC-MS）来增加代谢物覆盖率。GC-MS可用于检测非极性挥发性化合物和衍生后的中极性化合物，如糖、羧酸、游离脂肪酸和其他小油脂。此外，GCxGC-MS为色谱的分辨率提供了第二个维度，从而增加了已鉴定化合物的数量。LC-MS通常与反相柱一起用于分析不同类别的甘油脂、甘油磷脂、溶血甘油磷脂、鞘脂、肉碱、脂肪酰基、酰胺等。

在之前由同一小组进行的研究中，通过使用GC-MS和LC-MS平台[2,3,4,5]，对肝细胞癌（HCC）患者与肝硬化对照组的血液样本中代谢物水平的变化进行了广泛调查。肝癌是一种高度恶性的肝癌，发病率高，预后差。异质性表型和基因型特征，以及广泛的风险因素，使得有效诊断标记的鉴定和其病理生理学研究变得复杂。使用不同的平台有助于描述癌症发病引起的变化，并指导潜在候选生物标记物的选择。在本研究中，基于对15例人类肝组织样本的非靶向代谢组学分析，使用三种平台（GC-TOF-MS、GCxGC-TOF-MS和LC-QTOF-MS）评估HCC的特征。

研究队列

这15份肝组织样本是根据乔治敦IRB批准的方案从MedStar乔治敦大学医院招募的10名参与者中采集的。所有受试者都提供了签字的知情同意书。这些组织代表5例HCC患者（5个肿瘤和5个相邻的肝硬化组织）和5例肝硬化患者。病例组和对照组的受试者按性别、年龄、种族和BMI进行配对。

化学制品

八氟萘（OFN）作为定制标准从Ultra Scientific购买。脂肪酸甲酯标准（FAMEs）、C8、C9、C10、C12、C14、C16、C18、C20、C22、C24、C26、C28；盐酸甲氧胺（MEOX）、吡啶、去异喹、4-硝基苯甲酸和甲酸购自Sigma Aldrich。MSTFA 1%TMCS（N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺-氯三甲基硅烷）购自Thermo Scientific。代谢物提取采用HPLC级2-丙醇、乙腈和水。氦是从Robert Oxygen and Air Gas公司购买的。

样品制备

图1描述了15个组织样品的非目标代谢组学分析所遵循的样品制备步骤。在GC-MS和LC-MS分析中，肝组织匀浆，代谢物提取一步完成[2]。

特别是用1 mL预冷异丙醇：乙腈：水（3:3:2）匀浆20 mg肝组织，以提取代谢物并沉淀蛋白质。然后将样品在14500 g下在室温下离心15分钟，所得上清液分为两份，每份460μL，并在speedvac中浓缩至干燥（RC110B，Thermo Scientific，Waltham，Massachusetts，USA）。在后续步骤之前，将干燥样品保持在-20°C。

在GC-TOF-MS和GCxGC-TOF-MS分析之前，在500µL水中重新配制一份等分样品，其中100µL被干燥、冻干（-50°C）并衍生，以保护官能团并增加分析物的挥发性和热稳定性。将干燥样品与20μL MEOX试剂（20 mg/mL吡啶溶液）混合，并在60°C下加热1小时。然后在60°C下与80μL MSTFA反应1小时。向MEOX试剂中加入八氟萘（OFN），以监测系统性能和脂肪酸甲酯（C8、C9和C10-C28甚至），作为保留时间参考。将反应产物冷却至室温，进行涡流混合并进行分析。

用于LC-QTOF-MS分析的样品直接在200μL流动相中用加标的去异喹和4-硝基苯甲酸重新配制，以分别进行正模式和负模式分析的质量评估。

设备和参数

使用安捷伦7890 GC和双级调制器、MPS2自动采样器和LECO Pegasus HT（美国密歇根州圣约瑟夫市LECO公司）分析代谢物，并配备电子电离源和TOF分析仪。GC-TOF-MS数据是使用无分裂和分裂10:1注射模式获得的，以补偿组织代谢物的非常大或非常低的浓度范围。类似地，GCxGC-TOF-MS数据是使用两个拆分比率（20:1和40:1）生成的。使用Waters ACQUITY UPLC耦合到XEVO G2 QTOF（Waters Corporation，Milford，Massachusetts，USA），在正负极性下进行LC-MS分析。表1-3列出了每个平台采用的完整方法参数。

数据处理和统计分析

本研究中产生的多平台数据采用不同的化学计量学工具进行处理，以提取有价值的信息，包括被大量无关离子、噪声和污染所掩盖的生物学显著差异。

我们使用的数据处理管道如图2所示。

使用ChromaTOF GC软件和True Signal Deconvolution软件包（Leco Corporation）进行数据预处理，包括基线计算、峰值发现、反褶积和识别。对NIST 2011数据库和Fiehn Library（2013版）进行光谱相似性搜索，结果匹配范围为702至931，最高可能得分为1000。统计比较软件工具用于校准GC-MS数据[2]。LC-QTOF-MS数据首先使用MassLynx软件（Waters）的DataBridge程序转换为网络通用数据格式（NetCDF），然后使用XCMS包（1.44版，美国加利福尼亚州拉霍亚市斯克里普斯代谢组学中心）进行预处理和校准[6]。XCMS首先进行峰值检测，然后对样本中的峰值进行匹配，以计算保留时间偏差和离子比较的相对强度，最后进行缺失值插补。CAMERA（收集质谱数据注释相关方法）软件包用于离子注释（对来自同一分析物的所有加合物、簇离子和电荷态实体进行分组的过程）[7]。对数据进行过滤，使一个生物组中5个样本中至少3个样本中存在的离子保持不变。GC-MS数据中缺失离子的强度是相应生物组中最小值的1/6。此外，从GC-MS数据中消除了可能的污染、伪影和柱出血产物。对于LC-MS数据，XCMS通过重新读取原始数据文件并将其整合到缺失峰值区域来执行自动缺失值插补。

GC-MS和LC-MS数据通过使用BCA分析计算的样品中总蛋白值进行标准化[8]。应用对数变换将数据平滑至更正态分布。应用肿瘤与邻近肝硬化组织（HCC vs.ADJ-CIRR）之间的配对t检验（p≤0.05）和肿瘤与肝硬化组织（肝癌vs.CIRR。最后，计算褶皱变化和变化方向以建立相对定量。

使用MetaboSearch对LC-MS检测到的选定重要离子进行假定代谢物鉴定，MetaboResearch是我们之前开发的一种基于质量的工具，通过结合从人类代谢组学数据库、麦迪逊代谢组学联合会数据库、Metlin和LipidMaps[9]检索的信息来获得假定ID。

结果和讨论

分析后，共生成了六个不同的数据矩阵。在GC-MS分析中，所有3个平台中检测到的总离子数分别为720和427个无分裂和分裂10:1数据，1408和1222个分裂20:1和分裂40:1数据，以及6119和672个LC-MS分析的正离子和负离子模式数据。本研究中推测的代谢产物在GC-MS分析中的范围约为55-49%（无分裂和分裂10:1数据），在GCxGC-MS中的范围为22-24%（分裂20:1和分裂40:1数据），以及在LC-MS分析（正负极性模式数据）中的范围分别为5-15%。毫无疑问，GCxGC-MS和LC-MS的分辨率和灵敏度高于GC-MS，这与推测确定的代谢物与检测到的代谢品的比例有关，从而证实了表征和识别人类代谢组中未知代谢物的困难。

如图3所示的维恩图所示，在两个平台上只获得了少数化合物，在所有三种技术中只检测到一种重要的代谢物。这表明需要使用多平台方法来表征复杂疾病和标本。

应该注意的是，尽管这三种方法是互补的，但使用液相色谱法获得的数据量最大；然而，仅仅选择一个分析平台将明显阻碍潜在重要代谢物和可能的候选标记的识别。众所周知，使用反相色谱柱进行液相色谱分离会使检测中-非极性代谢物的分析产生偏差，并排除识别更具极性的化合物，这些化合物在癌症代谢中具有重要意义。例如，与克雷布斯循环和糖酵解有关的代谢物通常在液相色谱图的前面洗脱，这一区域的重现性较差。对于这些代谢物，GC-MS提供了更好的分离和鉴定能力。考虑到另一方面，单独使用GC-MS平台将阻止检测各种脂类，这些脂类在不同疾病的研究中变得越来越重要。

图4和图5给出了组合不同平台的重要性示例。使用GCxGC-MS平台可以解决GC-MS分析中低浓度和高浓度分析物的重叠信号（图5）。

在数据过滤和缺失值插补后，统计分析显示了几种化合物在不同疾病组中发生了显著变化，如图6所示。这些化合物属于各种生化类别，包括酸、二酸、氨基酸、碱、糖、磷酸化糖、糖醇、脂肪酸、核苷、核苷酸、单二和三酰基甘油酯、溶血磷脂酰甘油脂质、甘油脂质、鞘脂和肉碱。其中，氨基酸和磷脂在肝癌和肝硬化中上调，而羧酸、胆汁酸和长链肉碱则下调。

如图6所示，与HCC与相邻肝硬化组织相比，我们发现HCC与CIRR、ADJ-CIRR与CIRRs中组织代谢物的数量发生了显著变化。这可能是因为后一个比较中的样本来自同一组患者，因此表现出相对较小的诱导间变异性。此外，我们观察到，在三个比较中，基于LC-MS的组织分析导致具有统计意义的化合物数量最多，其次是GCxGC-MS。在比较ADJ-CIRR和CIRR时，GC-MS发现的最大数量的化合物处于无分裂模式。此外，我们发现三种化合物在所有三种比较中都有显著的统计变化。最后，只鉴定出一种属于糖醇类的化合物。该化合物通过GC-MS检测，分离比为10:1。

结论

在这项研究中，不同平台的组合以及GCxGC-TOF-MS和UPLC-QTOF-MS分析所实现的增强色谱分辨率使得能够检测出肝癌和肝硬化患者肝组织样品中的各种化合物。该研究证明了多平台方法在提高代谢组覆盖率和识别不同生物群组织中代谢物水平变化方面的能力。