介绍气相色谱-质谱（GC-MS）在代谢组学分析中的作用

虽然代谢组学不会直观地与挥发性化合物相关联，但气相色谱-质谱联用（GC-MS）具有许多优点，使其在代谢组分析领域广泛有用。代谢组学或代谢组学的文献检索说明了这一点，它返回了大量的出版物，详细介绍了GC-MS成功用于分析各种样品的情况。这些应用包括从食品工业和农业，到药物和疾病生物标记物发现应用[1-4]。

作为一种分离方法，气相色谱以其高重复性和强大的分辨能力而闻名。它通常与MS分析仪耦合，如三重四极杆（QqQ），可用于定性和定量分析，以及飞行时间（TOF）仪器，可确定精确到小数点后4位的质量。从GC柱中洗脱出来的化合物与质谱直接兼容，因为它们已经处于气相，因此很容易被电子冲击源或化学电离电离。固定电子电压通常用于对分子进行重复离子化和碎片化，因此可以构建数据库来记录质谱和保留时间，从而为可跨分析平台共享的化合物提供高度准确的2D数据库。GC-MS作为代谢组学工具的早期采用促进了各种此类数据库的创建，这些数据库涵盖毒理学、法医学和生物学应用。在记录保留时间的库中，FeihnLib[5]被公认为GC-MS的主要代谢物库。该库中的代谢物使用保留时间锁定（RTL）方法进行记录，该方法包括使用特定的柱和碎片能量在稍微不同的环境下对齐化合物。这允许GC-MS用户在RTL校准仪器上重复该方法并获得相同的结果，因此允许他们匹配库中的未知化合物[6,7]。

非靶向代谢组学研究旨在描绘生物体代谢组的“指纹”，包括检测和定量样品中最大可能数量的化合物，以便比较多组样品并获得有用的生物学见解[8]。在这方面，非挥发性化合物的检测在GC分析中是有限的，除非首先衍生这些分子以增加其挥发性。幸运的是，一系列选择性和非选择性衍生试剂可用于修改化合物挥发性，提高稳定性，并改善色谱行为，如分辨率和峰拖尾。常见的衍生物是通过某些官能团的酰化、烷基化或硅烷化制备的[9，10]。当应用于生物流体分析时，必须执行初步干燥步骤以去除水分否则将与衍生试剂发生反应的水有效地猝灭了反应。然而，GC-MS的衍生程序可以在水环境中进行，并选择适当的试剂。具体示例包括在与生物样品相关的自然水环境中制备硫氨基酸的N，S-乙氧羰基甲酯和N（S）-异丙氧羰基甲基酯衍生物[2,11]。可以购买高效、可重复且使用相对简单的现代衍生试剂盒。此外，在执行数据库搜索时，使用产生三甲基硅基（TMS）衍生物的试剂是有利的，因为已经生成了大量TMS衍生物库以帮助识别代谢物。

在确定重要代谢物后，通常应对这些化合物进行定量。由于内部标准的使用有限或不存在，在非目标研究期间收集的数据通常不适用于定量。尽管如果仔细选择代表一类化合物，可以使用单一标准提取半定量结果。这是由于非目标分析中数据收集和提取的性质造成的。通常，MS分析仪将设置为扫描m/z范围，以便检测尽可能多的化合物，并且可以通过反褶积从信号中提取总离子电流（TIC）中的特定化合物。这种方法的问题是，反褶积信号不是一个真实的响应，而是一个数学产品，它可能会受到参数变化的影响[4]。此外，与选择性地将仪器设置为感兴趣的特定m/z值相比，使用MS扫描模式时，灵敏度会降低，从而允许更多的离子在相同的给定时间内到达检测器。QqQ检测器的使用非常适合于此目的，因为它们可以在碎裂前后选择性地排除离子，以确保到达检测器的离子来自预期的前体分子。这种串联质谱实验被称为选择性/多反应监测（S/MRM），极大地提高了选择性和灵敏度，这两者在复杂基质中代谢物的分析中都至关重要[12]。

To collect high quality quantitative data it is common practice to use an internal standard which can take into account sample preparation and injection errors. The use of internal standards in GC-MS greatly improves standard deviations, where the usual RSD is <5%, compared to external standard calibration which can be up to 20% [13]. Ionisation of molecules in the source of a mass spectrometer can be variable and also be influenced by other co-eluting compounds which can suppress the ionisation of the former. As a result, for quantitative analysis this effect should be considered when choosing an internal standard. The ideal internal standard for GC-MS mimics the compound of interest as closely as possible and for this purpose isotopically labelled analogues of the compound being analysed are best suited. The degree of deuteration must be sufficient to allow the deuterated molecular ions to be resolved from those of the natural isotope. Assuming the acquisition of isotopically labelled internal standards is feasible and affordable, accurate quantitation can be performed at very low levels in complex biological samples.

尽管GC-MS存在一些缺点，例如增加了极性分子的样品制备，但该技术在再现性、灵敏度和与综合库的兼容性方面的优势证明了其继续用于代谢组分析。针对非挥发性分子的稳健衍生协议的开发将此技术的范围扩展到更广泛的代谢物，并与其他平台（如液相色谱）重叠。这允许使用仪器协同工作，通过分析具有广泛物理化学性质的代谢物，全面绘制生物体或样品的剖面图[8]。