腺相关病毒（AAV）超高灵敏度分析十二烷基硫酸钠毛细管凝胶电泳测定衣壳蛋白-草芽圈-科技服务专业网站

腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）是目前应用最广泛的基因治疗载体之一，具有转基因长期表达和良好的疾病纠正史。在载体生产期间，应密切监测几个质量控制（QC）参数，以符合临床安全性和疗效要求。其中，AAV病毒蛋白的纯度分析对产品的质量保证和安全性至关重要。本文介绍了两种用于腺相关病毒衣壳蛋白分析的十二烷基硫酸钠毛细管凝胶电泳（SDS-CGE）工作流程。一种是利用紫外线检测完整的形态，另一种是用荧光标记增强灵敏度的激光诱导荧光检测。

1.简介

AAV是细小病毒家族的成员，是最小的DNA病毒之一，直径约为20 nm。重要的是，它们是非包膜、复制缺陷型病毒。AAV由围绕约4.8千碱基（kb）DNA基因组的三个衣壳蛋白组成[1]。这三种病毒衣壳蛋白的大小分别为87kD（VP1）、73kD（VPN2）和61kD（VP3），并以约1:1:10摩尔比率组装[2,3]。其中60个亚基形成了完美的二十面体结构[4，5]。在AAV制造和释放过程中，应快速、高分辨率地分析杂质，包括培养基和纯化过程中残留的宿主细胞和辅助病毒相关蛋白[6]。

各种血清型AAV由于具有长期转基因表达和良好的疾病治疗能力等特点，已成为基因治疗发展的诱人治疗载体[7]。腺相关病毒的假原型在个体基因组/衣壳结构上表现出新的取向性和生物学特性，因此大大提高了系统的适用性和通用性。目前，已经确定了13种人类AAV血清型，这增加了这种特殊载体在基因治疗中的适用性，因为不同血清型对不同器官和组织具有不同的嗜性[8]。大多数AAV血清型的细胞粘附利用与各种细胞表面糖蛋白的碳水化合物部分的结合，这是成功转导的重要第一步。AAV血清型可通过将其受体识别为硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（AAV2、AAV3、AAV6和AAV13）以及N-连接的低聚糖：末端唾液酸（AAV1、AAV 4、AAV5和AAV6）和末端半乳糖（AAV9）类型进行分组[9]。因此，对病毒衣壳蛋白及其分布率进行定性和定量分析具有重要意义。

SDS-CGE是细胞和基因治疗领域流行的AAV衣壳蛋白分析方法之一。SDS-CGE提供自动化蛋白质分离，具有卓越的分辨率和定量能力[10]。该方法可以同时使用紫外线和激光诱导荧光（LIF）检测器。前者不需要预分离标签，但灵敏度较低。另一方面，LIF检测需要对衣壳蛋白进行荧光标记，但具有几个数量级更高的灵敏度。本文介绍了两种SDS-CGE工作流程：1）未标记衣壳蛋白的UV检测和2）共价染料标记后的LIF检测。

实验

材料：十二烷基硫酸钠、甲醇、N-乙基马来酰亚胺（NEM）和2-巯基乙醇均来自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。Amicon Ultra-0.5离心过滤器（10000和30000 NMWL）购自EMD Millipore（美国马萨诸塞州Billerica）。ATTO-TA FQ（3-2-（呋喃酰喹啉-2-甲醛）胺衍生试剂盒购自美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科学公司。SDS-MW分析试剂盒来自SCIEX（美国马萨诸塞州弗雷明翰），包括SDS-MW凝胶缓冲液和100 mM Tris-HCl（pH 9.0）和1%SDS的SDS-MW样品缓冲液。包装好的pAV-CMV-GFP AAV2（滴度2.24 x1013 GC/mL，（每毫升基因组拷贝数）、pAV-CSV-GFP的AAV8（滴度3.99 x1013 GC/mL）和包装好的p AV-CMV-GFP AAV8，滴度1.57 X1014 GC/mL）购自Vigene Biosciences（美国马里兰州罗克维尔）。三份样品保存在磷酸盐缓冲盐（PBS，pH 7.5）和0.001%pluronic F68存储溶液中，并在相同的存储缓冲液中稀释至所需浓度。添加后者是为了最大限度地减少AAV粘附在疏水性塑料表面上。

Sample Preparation: For UV absorbance detection, 5 μL of AAV solution (salt concentration of < 40 mM) was mixed with 5 μL of 1% SDS and 1.5 μL of 2-mercaptoethanol and incubated for 10 min at 50 °C to fully denature the sample proteins. After the denaturation step, 90 μL of DI water was added to the sample mixture. Buffer exchange was necessary if the salt concentration in the AAV sample was higher than that of 40 mM. For FQ labelling and LIF detection, 10 μL of AAV sample solution was mixed with 1.2 μL of 4% SDS in 150 mM NEM solution in a microfuge tube and incubated for 5 minutes at 70 °C followed by mixing with 1.5 μL of 2.5 mM FQ dye working solution and 1 μL of 30 mM KCN solution.

将标记反应混合物在70°C下培养10分钟。通过添加28μL的1%十二烷基硫酸钠（SDS），在70°C下再保持5分钟，使反应停止。淬火步骤结束后，向稀释的反应混合物中添加20μL去离子水。标记的样品立即用于SDS-CGE-LIF分离。

毛细管电泳

PA 800 Plus药物分析系统配备了紫外线和LIF检测器。对于所有分离，施加500 V/cm电场强度。这个

EZ-CE预组装毛细管盒（裸熔融二氧化硅，内径50μm，总长度30 cm，有效长度20 cm，SCIEX）填充基于聚合物的SDS-MW凝胶缓冲系统。检测：UV:214 nm，LIF:488 nm激发波长，带600 nm/80 nm发射带通滤波器。将分离温度设置为25ºC。堆积注射：在20 psi下预注水0.4-0.6 min，然后在5-10 kV下注入样品1 min。数据采集、处理和分析采用32 Karat软件10包进行。

结果和讨论

各种血清型腺相关病毒最近正在成为最常用的基因传递载体之一。因此，从制造和监管角度来看，它们的纯度分析非常重要。本文介绍的用于衣壳蛋白高灵敏度纯度分析的十二烷基硫酸钠毛细管凝胶电泳工作流程利用紫外线和激光诱导荧光检测，后者需要共价荧光标记。

SDS-CGE-UV检测工作流

首先，在1012-1014 GC/mL浓度范围内，使用SDS-CGE对AAV8和AAV2血清型进行紫外检测分析。图1中的上部（A）和下部（B）轨迹分别描述了AAV8和AAV2血清型的分离。可以观察到，这两种样品类型的所有三种衣壳蛋白都得到了基线分离。AAV8样本的VP3:VP2:VP1比率约为8:1:1，而AAV2样本的VP3比率为7:1:1。尽管如此，理论上的比率是10:1:1，但实际上这些比率并不一定完全匹配。多种因素可能会影响VP比率，例如针对不同取向的病毒蛋白重组设计、生产工艺条件等[11,12]。比率测量中观察到的微小差异可能会影响所检测的两种病毒的形状。

In both traces a small peak is visible in front of the VP3 peak (depicted as VP3’), which is probably a small portion of the VP3 capsid protein with altered post translational modification as suggested in [13]. The migration time and relative peak area reproducibility values were less than 0.34% RSD and 0.75% RSD (n=8), respectively.

SDS-CGE样品制备的一个重要方面是变性阶段的培养温度。此过程通常在90ºC下完成3-5分钟，以确保蛋白质完全变性。然而，应降低敏感蛋白质的温度，以避免在变性步骤中可能发生的分解。图2比较了AAV8血清型样本在90ºC（上迹线）和70ºC的孵育10分钟后的SDS-CGE-UV迹线。可以看出，较高的温度培养导致出现一些分解产物，在上部电泳图中表示为D1和D2。这些分解产物可能来源于VP3蛋白，因为该峰值似乎在两个痕量之间减少，然而，这一假设需要通过进一步的实验进行验证。此外，较高的温度变性步骤也导致VP3和VP3峰之间的分辨率明显降低，可能是由于分解相关过程。

The limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) values were assessed for the AAV8 sample with UV detection using the industry standard dilution series method [14]. The LOD was 1 x1012 GC/mL (peak to noise ratio 5) and the LOQ was 5 x1012 GC/mL (peak to noise ratio 15), with the linear detection response of r2 =0.9991 in the concentration range of 5 x1011 – 1 x1014 GC/mL.

SDS-CGE-LIF检测工作流

虽然SDS-CGE分离完整的腺相关病毒衣壳蛋白期间的UV检测提供了足够的定量限（如上所示），但生产过程中的过程控制需要更高的灵敏度，最好≤1 x1010 GC/mL（~50 ng/mL），这是基因治疗中典型的AAV浓度。为了提高检测灵敏度，在用3-2-（呋喃酰喹啉-2-甲醛）（FQ）染料对衣壳蛋白进行荧光标记后，使用激光诱导荧光检测。样品制备程序（包括FQ标记反应和淬火步骤）耗时不到一个小时。AAV8和AAV2样品的电泳图谱如图3所示。再次，对所有三种病毒衣壳蛋白进行基线分离，VP3:VP2:VP1比率分别为8:1:1和7:1:1，也就是说，荧光标记没有改变总的峰分布曲线。

The detection and quantitation linearities were evaluated as in the UV detection method, but in the 1 x1010 – 1.6 x1014 GC/mL range. The linear detection response result was r2 = 0.9989 with the LOD and LOQ values of 1 x1010 GC/mL and 3 x1010 GC/mL for the VP3 peak.

结论

随着生物制药行业越来越广泛地将腺相关病毒视为基因治疗的运载工具，可靠的定量分析对其正确表征和杂质定量至关重要。

In this paper, sodium dodecyl sulphate capillary gel electrophoresis was employed for ultrahigh sensitivity AAV capsid protein analysis using UV detection for intact and LIF for fluorophore labelled forms. Both approaches resulted in excellent size separation of the VP1, VP2 and VP3 proteins along with the resolution of a small VP3 impurity peak (VP3’). The migration time reproducibility for both methods was <0.34% RSD, while the corrected peak area reproducibility was <0.75% RSD for SDS-CGE-UV and < 5% RSD for the SDS-CGE-LIF analysis of the fluorophore labelled capsid proteins. The linearity of detection ranged over two orders of magnitude for UV detection (LOD = 1 x1012 GC/mL) and four orders of magnitude with LIF detection (LOD =1 x1010 GC/mL).

确认

作者非常感谢与Elliott Jones、Sahana Mollah和Fang Wang进行的富有成果的讨论。

工具书类

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