摘要:氯霉素是禁止用于食品生产动物的药物中最常见的检测物质之一。因此,在动物源性食品中控制氯霉素是必要的。我们开发了一种方法,可以在负电喷雾模式下使用QuEChERS方法和HPLC-MS/MS测定22种不同基质中的氯霉素。该方法已根据欧盟标准成功验证。


1.简介

氯霉素(CAP)是一种广谱抗生素,自20世纪50年代以来广泛用于家畜,并已成功应用于所有动物物种。公认的CAP对人类的毒性影响导致其在兽医实践中的使用受到限制[1]。1994年,由于缺乏CAP的安全残留水平,欧盟禁止将其用于食品生产动物的兽医用途,并且没有为这种抗生素制定最大残留限量(MRL)。由于欧盟禁止使用该物质,因此设定了0.3μg kg−1作为最低要求性能限值(MRPL)[2,3]。然而,来自食品和饲料快速警报系统(RASFF)过去14年的数据表明,各种基质中都存在CAP污染,其中有488起CAP触发通知事件,442起食品通知事件,46起动物饲料通知事件。所列通知涉及多种食品,如动物饲料、水、牛奶、鱼、蜂蜜和肉。动物源性食品中CAP的来源是一个复杂的问题,取决于许多因素。CAP迅速代谢,并作为主要代谢物葡萄糖醛酸CAP(CAPG)在尿液中排泄[4]。因此,需要一种简单、灵敏、快速的检测CAP和CAPG残留的方法。根据文献,CAP残留也可能存在于加工食品中,例如熟食[5],因此可以假设预热食品也可能含有CAP残留。此外,经验表明,CAP可以从牛奶转移到乳制品中,如白干酪、奶油、黄油和乳清[6]。此外,根据CAP监测项目的结果,可以在鸡蛋、蜂王浆、肉、牛奶和乳制品等产品中发现CAP[7]。这个问题需要回答,本文介绍了在22个不同的矩阵中测定CAP的方法,这些矩阵可能存在CAP并且应该进行分析。

许多基质(各种类型的生物材料)中禁用物质残留测定方法的开发是一个多阶段和复杂的过程,必须考虑各种基质,如脂肪、蛋白质、水、糖和各种食品添加剂。所有这些不同的基质都可能含有杂质,从而导致质谱色谱图上出现许多重叠和漂移背景[8]。近年来,在各种基质中,主要基于气相色谱法和液相色谱法,并使用各种检测形式,开发了测定氯霉素的色谱法[4-6,8-11]。然而,液相色谱-质谱联用检测器中新的大气压电离技术的发展有助于氯霉素残留检测的可靠技术的出现。这些是目前最常用的CAP测定方法[1,6,8,12-19],但是关于在大量矩阵中测定CAP的文章很少[1,6,12-17]。本研究的目的是通过采用QuEChERS方法,使用HPLC-MS/MS系统确认和定量22种不同基质中的CAP残留,并根据委员会决定2002/657/EC[20]的标准进行验证,从而创建一种简单、廉价、快速、回收率高、提取物纯化好的方法。


2.实验段

2.1材料和方法

Acetonitrile, isopropanol, and ethyl acetate were obtained from Merck (Darmstadt, Germany). Primary and secondary amine (PSA) was purchased from Supelco (Bellefonte, PA, USA). Sodium chloride (NaCl) and methanol were purchased from P.O.Ch. (Gliwice, Poland). CAP, CAP-D5 Anhydrous sodium sulphate (Na2SO4), anhydrous magnesium sulphate (MgSO4), and β-glucuronidase type HP-2 were procured from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Pre-heated magnesium sulphate (MgSO4) was prepared in our heating laboratory (400°C overnight). Octadecylsilane sorbent (C18), ammonium acetate, and acetic acid were obtained from J.T. Baker (Deventer, The Netherlands). All reagents were HPLC grade. Nanosep MF filter was supplied by Pall (Port Washington, NY, USA). Ultrapure water was filtered through a Millipore Milli-Q system (Burlington, MA, USA). Kinetex C8 column (75 mm x 2.1 mm x 2.6 μm) and C8 precolumn (4 mm × 2.1 mm × 4 μm) were obtained from Phenomenex (Torrance, CA, USA). Stock standard solution of CAP and CAP-D5 (1 mg mL−1) were prepared in methanol and stored in the dark in a 10 mL amber volumetric flask. This standard will remain stable for 12 months when stored at < −18°C. The working standard and internal standard solutions at the level of 0.01 μg mL−1 were prepared in methanol and stored in the dark in a 5 mL amber volumetric flask. This standard remains stable for 12 months when stored at <6°C. For the procedure optimisation and validation, milk, curd cheese, whey, butter, and sour cream with various protein and fat content, eggs, muscle (different species), liver, kidney, honey, sausage, ham, headcheese, intestines, aquaculture products (different species), royal jelly and mead were collected from supermarkets. The animal feed (for different species of livestock, such as pigs and poultry) were collected from a feed producer. Water, plasma, and urine (from different livestock species) were obtained. The samples have been checked for absence of CAP residues.


2.2.高效液相色谱-质谱联用仪

HPLC-MS/MS系统由连接至ABSciex API 5500 Qtrap质谱仪的ABSciex-ExionLC HPLC系统(加拿大安大略省康科德)组成。Analyst 1.6.3软件控制HPLC-MS/MS系统,Multiquant 3.2用于处理数据。MS系统在毛细管电压为4.5 kV的电喷雾负电离模式下运行。倍增器设置为1900 V。脱溶温度设置为500°C,碰撞气体(N2)-3.1×10e−5 torr;雾化器气体(N2)-36 psi;气体1(空气)-35 psi;气体2(空气)-35 psi;气幕气体(N2)-36 psi。色谱在连接到C8预柱的Kinetex C8柱上进行。液相色谱分析流动相由两种溶剂组成:A(0.5%异丙醇溶于0.1%乙酸中)和B(甲醇)。流动相(A:B,v:v)的组成从15%的B开始至2.5 min,然后在3.0 min时为45%,并保持3 min,然后15%,保持3 min。平衡时间为3 min。柱在40℃下以0.4 mL min−1的流速操作。多反应监测(MRM)监测的离子为321个→194和321→152.去簇电位(DP)为−105 eV。CAP的优化碰撞能量(CE)为第一个产物离子的−16 eV,第二个产物离子为−22 eV。


2.3.样品制备

对于尿液、血浆和匀浆的肝脏、肌肉和肾脏,将2±0.05 g样品与30µL工作溶液内标物(CAP-D5)混合。此后,添加1.5 mL 0.05 M醋酸盐缓冲液(pH 5.2)和50µlβ-葡萄糖醛酸酶。将样品混合约60秒,并在50°C的温度下水解1小时。

首先用液氮匀浆肠道样品,然后将2±0.05 g样品与30µL内标工作液(CAP-D5)混合,并在349×rcf的涡流混合器上与1.5 mL水混合0.5 min。

对于其他基质,将2±0.05 g均质样品与30µL内标工作溶液(CAP-D5)在349×rcf的涡流混合器上与1.5 mL水混合0.5 min。

在此步骤后,将所有样品与10 mL乙腈(如3.2所述的最佳溶剂)混合。然后,添加0.5 g NaCl,并在349×rcf的涡流混合器上混合1 min,并在2930×rcf下在约6°C下离心10 min。然后,将7 mL顶层转移到新的离心管中,然后添加100 mg PSA、200 mg C18和600 mg预热无水MgSO4。然后将该提取物在349×rcf的涡流中混合2分钟,并在约6°C的2930×rcf下离心10分钟。然后将5 mL顶层转移到新的离心管中,并在大约45±5°C的温和氮气流下蒸发。残留物在0.3 mL 0.5%异丙醇和0.1%乙酸中重新溶解,在室温下用Nanosep MF过滤器(0.22µm)在9447×rcf下离心10 min,并转移到自动进样瓶中进行分析。


2.4.方法验证

该方法根据委员会第2002/657/EC号决定[3]的要求进行了验证。评估了验证参数:选择性、线性、重复性、实验室内再现性、回收率、不确定度、判定限(CCα)和检测能力(CCβ)[20-23]。在选择性研究中,通过分析每个基质的20个不同来源的空白样品,检查了方法中可能遇到的干扰。根据基质匹配校准曲线评估线性,校准曲线是通过在对应于0.1(或0.15,取决于基质)的六个浓度水平下强化空白样品(针对每个基质)制备的;0.3; 0.45; 0.6; 1.2; 2.4μg kg−1含有内标物(0.6μg kg-1)[19]。在四个浓度水平(每个水平六个样品)0.1(或0.15,取决于基质)下测定重复性和再现性;0.3; 0.45; 0.6微克千克-1。对于饲料(猪、家禽)、水产养殖(鱼、虾)和肌肉(鸡、猪)等基质,验证中的样品平均分配。为了重复性的目的,由相同的操作员在同一天使用相同的仪器对样品进行分析,并计算为相对标准偏差(RSD,%)。为了在实验室内再现性,由不同的操作员在两个不同的日期使用相同的仪器对另外两组空白样品进行强化和分析,并计算为相对标准偏差(RSD,%)。通过比较样品的平均测量浓度和强化浓度来计算回收率[20-23]。


3.结果和讨论

3.1.HPLC-MS/MS条件

将0.5%异丙醇与0.1%乙酸水溶液:甲醇混合,可获得CAP的最佳分离效果(对称的峰形和最小的基质效应)。图1显示了肠、黄油、凝乳干酪、血浆、蜂蜜和尿液样品的空白和强化样品的0.3μg kg−1的色谱图示例。


3.2.样品制备的优化

氯霉素的测定可分为1。通过水解步骤进行测定(其中CAP主要以葡萄糖醛酸形式存在(肝、肾、尿、血浆))和2。母体药物(水、饲料、牛奶和奶制品、鸡蛋、蜂蜜、蜂王浆、肌肉和水产养殖产品)的直接测定。

当未确认CAPG时,水解步骤的最短时间和最低温度下的最重复结果在1小时后和至少50°C的温度下获得。许多程序描述了生物基质中CAP残留的测定,如蜂蜜、肝脏、肌肉、肾脏、牛奶和乳制品[1,6,13-17],但只有少数程序可用于不同种类的动物源性食品基质[1,6,9,13-19]。根据我们的研究,我们决定使用乙腈进行CAP分析,因为这是回收率(图2)和提取物纯度之间的折衷(提取物的纯度是通过提取步骤后色谱图中磷脂干扰的数量来测量的),它是生物样品分析中最麻烦的成分之一,难以通过高效液相色谱法测定代谢物或外源物质,尤其是当与串联质谱联用时。

为了比较回收率,用乙腈、乙酸乙酯、丙酮和氯仿:丙酮(50:50)处理样品,然后离心。所有基质的最佳结果(回收率)均为乙腈。其他混合物,如乙酸乙酯、丙酮和氯仿:丙酮对黄油、奶酪、饲料和脂肪产生不良影响。大量的共萃取基质化合物阻止了蒸发至干燥。对于含有乙酸乙酯(乳剂)的鸡蛋,结果也很差。丙酮:氯仿和丙酮对其他基质的回收率同样很低(图2)。

对于某些基质(肌肉、水产养殖产品、水、乳清、肝脏、肾脏、火腿、头酪、香肠、肠、蜂蜜酒、蜂王浆、蜂蜜、血浆和尿液),更好的溶液(回收)可能是乙酸乙酯,但由于关键目标是简化程序并生产高纯度提取物,决定使用乙腈从所有基质中提取。根据我们在选择乳制品CAP测定条件方面的经验,选择了试剂的其他参数(NaCl、C18吸附剂、PSA、无水MgSO4)[6]。


3.3.方法

验证结果

根据关于质量标准[20]的第2002/657/EC号决定,对整个程序进行了验证。表观回收率在93.1%至108.0%的范围内,重复性小于9.2%,实验室内重复性小于13.1%。判定限和检测能力值如表1所示。

在MRPL水平[21]下计算扩展不确定度(表1)。所有基质CAP基质效应的离子抑制计算值均低于建议限值±25%,这表明这不是该方法的问题[24](表1)。通过绘制内标校正的峰面积与标称浓度的相关系数值,在每个基质中均高于0.98。


4.结论

验证研究表明,该方法是测定所有验证矩阵中CAP和CAPG残留的可靠验证策略。二十二种基质中CAP的检测限和检测能力低于0.3μg kg−1(MRPL)。这种基于QuEChERS和HPLC-MS/MS组合的简单方法表明,基于QuECh ERS方法的各种基质中CAP的总测定也可以成功应用于验证期间未验证的许多其他基质。波兰国家监测控制计划中使用了这种方法。


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