数据无关分析的发展：UPLC-离子迁移质谱复杂样品分析

摘要

非目标筛查是一种成熟的分析策略。然而，克服样本复杂性仍然是一项重大挑战。在过去二十年中，高分辨率质谱（HRMS）和液相色谱（LC）技术不断发展，为解决样品复杂性提供了更大的峰容量。离子迁移率（IM）分离提供了第三维分辨率和碰撞截面值（CCS）；额外的分析物描述符。在这里，我们回顾了LC-MS技术在药用植物筛选中的应用进展。超性能液相色谱-离子迁移率质谱法（UPLC-IM-MS）缩短了分析周期，提高了峰容量，有助于识别异构体、“已知”和“已知-未知”分析物，以生成增强的形态分布。

导言

使用高分辨率质量测量的LC-MS技术是鉴定复杂样品（如药用或农业重要植物）中成分和生成植物化学剖面的重要工具。由于技术的发展，在过去二十年中，使用准确的海量数据的非靶向筛查分析的流行率有所增加。前体离子（尤其是小分子）的精确质量测量的使用，为化合物确认注入了更大的信心，因为检测到的分析物的元素组成可以确定。通过生成准确的大量产品离子信息，也可以提高识别特异性。在数据相关非目标筛选的情况下，通常在同时获取两个数据通道（MSE）的情况下执行采集，第一个数据通道包含前体离子信息，第二个数据通道使用碰撞能量斜坡获取，根据保留时间（tr）比对，生成可与其前体离子相关的碎片离子。这种策略有助于生成准确的质量前体和碎片离子结构解释信息，而无需生成目标列表。信息学和质谱仪器的进步导致了高分辨率质谱（HRMS）的使用增加，包括正交加速飞行时间（oa-TOF）和四极飞行时间（Q-TOF。传统的Q-oa-TOF-MS平台包括一个四极杆（用于前驱体质量选择、MS/MS和定量）、一个碰撞池和一个飞行时间分辨质量分析仪，该分析仪结合了反射子技术以增加飞行时间路径长度和随后的质量分辨力。对于全谱采集，四极杆在仅射频模式下工作，作为宽带通滤波器，以传输宽质量范围。连续离子束被选通并脉冲送入正交加速器，在那里离子沿飞行管加速并沿着聚焦路径到达探测器。在质量分析仪中，较轻的离子比较重的离子移动更快，并根据质量电荷比进行解析。在Q-IM-oa-TOF-MS平台中，四极杆和质量分析仪之间包括离子迁移率分离装置（见图1）。如今，在一次分析中检测数千个成分是一种常规做法，随后可以进行有针对性的回顾性数据分析。

商业上引入了亚2µm颗粒，其系统在较高的背压和高流动相线速度下运行，有助于减少色谱梯度的长度，同时保持或增加峰值容量，并提高灵敏度[5]。

尽管在液相色谱和质谱（包括MS/MS）方面取得了这些进展，但确认特定分析物的存在仍然是一个挑战，特别是当异构体/结构相关化合物产生相同的异构体产物离子并且存在共萃取基质组分时。一个例子是药用植物中黄酮类化合物的鉴定。已鉴定出4000多种黄酮类化合物，它们是一类广泛存在的化合物，具有多种药理和生物特性[6]。西番莲属包含约500种植物，其中每种都含有芹菜素/木犀草素类黄酮衍生物（C-糖基黄酮），经常作为异构体出现[7]。通过表征和鉴定异定向素/定向素、异牡荆素/牡荆碱的8-C和6-C糖苷关键异构体对比率，可以区分西番莲的四个物种：-美味西番莲、阿拉塔西番莲和肉身西番莲[8]。这两种8-C和6-C糖苷形式具有独特的同分异构体正离子和负离子电喷雾产物离子光谱。然而，在数据相关或目标分析策略中使用此类特定特征分析物信息可能会受到样品复杂性的阻碍。

非处方（OTC）草药的疗效监管和评估超越了植物化学分析。为了确保消费者安全，需要进行质量控制，以确定纯度并确定是否存在熏蒸剂、杀虫剂、真菌、真菌毒素和细菌（沙门氏菌和大肠杆菌）。需要进行分析以优化提取程序和提取物的混合，从而在最终产品草药配方中产生已知数量的活性成分。环境条件也会影响植物化学成分。还需要评估与储存条件、包装和湿度有关的商品稳定性和降解。受控临床试验中的疗效需要标准化提取物和标准化剂量。在这里，我们回顾了LC-MS分析的进展，这些分析可用于克服植物药物特征化方面的挑战，并促进对植物化学非处方商品产品的特征分析。

在本文中，我们利用LC-MS技术的进步，特别是超高效液相色谱与离子迁移质谱（UPLC-IM-MS）的耦合，提供了三维分离，深入了解了如何克服样品复杂性的挑战；m/z，色谱和离子迁移率分辨率。IM仪器的商业化（Waters Corporation，Milford，MA，USA-SYNAPT（2006））[9,10]导致引用IM的出版物不断增加[11,12]。IM是气相离子的一种特性，与它们在缓冲气体中相对于外加电场的速度有关，其中IM的分离取决于离子的质量、电荷和形状[13]。Dwivedi等人利用LC、MS和IM说明了峰值容量增加2到10倍的因素，这取决于MS和IM-分辨率[14,15]。使用碰撞截面（CCS）值作为辅助识别的附加描述符的分析策略有所增加，结合MS测量和tr，它们提供了一个补充指标[16-18]。已采用色谱和质量分辨率分离策略的发展，以达到使用离子迁移率的终点，西番莲的形态分析扩展到仅依赖两个已知的关键异构体对（见图2）。“已知-未知”化合物被定义为一种分析物或特征，通过在多个样品中和跨多个样品的多度量分析测量来持续检测和表征[19]。结合“已知”、“已知-未知”和“已知-已知”的识别，可以获得全面的成分标记指纹，以控制植物药物的质量并描述药用植物的植物化学组成[20-23]。

实验性

示例信息：

之前已经描述了本研究中使用的所有植物材料，即化身P.intaborata、美味P.edulis、蓝斑P.caerulea和白斑P.alata的凭证样本的制备[8]。根据巴西药典程序，使用乙醇/水（2:1 v/v）、1 g植物/10 mL溶剂进行提取[24]。

色谱和质谱条件

高效液相色谱（HPLC）-oa-TOF-MS、UPLC-IM-MS实验和处理参数已在之前的其他地方进行了描述[8,25-27]。

结果和讨论

西番莲变种的特征分析突出了复杂样品分析的挑战，这在代谢组学、代谢物鉴定和食品安全（兽药残留、农药残留分析）等众多研究领域都很常见。质谱技术和信息学的不断进步释放了高特异性、数据无关的非靶向筛选的潜力。图3显示了西番莲的三维分辨率，包括m/z、色谱和离子迁移率分离。UPLC-IM-MS为Cao等人和Zhu等人[28,29]讨论的二维分离技术提供了另一种策略。保留时间和漂移时间（DT）校准光谱提供了类似于定向MSMS的特异性，但使用四极杆进行目标分析物质量预选的必要性被否定。所有IM分解的前体分析物也会生成CCS值，这可以区分异构体物种。观察到的和预期的CCS（λ2）值与tr（min）和m/z准确质量（ppm）一起定期报告。

The ability to achieve higher mass resolutions is a major factor in overcoming the challenges of complex sample analysis, since it facilitates the separation of isobaric species which improves m/z specificity. Increases in oa-TOF-MS mass resolution from > 5000 FWHM to > 50000 FWHM are illustrated at m/z 556 [M+H]+ for the TOF-MS system lock mass leucine enkephalin in Figure 4 and compared to unit resolution of a quadrupole MS instrument. The introduction of UPLC facilitated a 66% reduction in total analysis cycle time to 17 mins (50 min using HPLC), for the analysis of Passiflora species (see Figure 4) and chromatographic base peak widths were sharpened from ~ 1min to ~ 0.1 min (for the 17 min UPLC gradient used). The enhanced peak capacity [5] provides further component separation and correspondingly cleaner retention time aligned product ion spectra in MSE experiments. UPLC improves S/N due to the reduction in band broadening, and thus an increase in sensitivity. Extracts analysed using UPLC-IM-MS were diluted 40:1 compared to those used for HPLC-oa-TOF-MS.

在我们使用正模式ESI进行的初始HPLC-MS研究中，确定了不同的碎片离子分布[8]。在异常高的碰撞诱导解离（CID）碰撞能量下，异构体对形成差异化的异构碎片离子。精确的质量测量证实了元素测量，并重申了可用于区分6-C和8-C糖苷异构体的特征信息的发现，如图5中异定向素和定向素[8]所示。随后，使用UPLC-IM-MS负模式ESI，识别出特征性6-C和8-C糖苷片段离子（见图6）[25]。对比图5和图6，还说明了信息学的演变，其中检测到的分析物结构和碎片解离路径被纳入目标数据处理结果中。尽管色谱和质量分辨率的发展带来了峰容量的提高，但样品复杂性导致的系数可能会阻止获取非目标单组分碎片离子数据。然而，离子迁移促进了额外的分离维度。共溶等压物种、代谢物或异构体（可能产生相同的产物离子）会产生混合碎片离子光谱（MSE），但当使用离子迁移率（HDMSE）将其额外分离时，会出现单组分碎片离子光谱。

利用UPLC-IM-MS和CID的联合特异性对非靶向认证特征进行了研究，以明确识别类黄酮分析物TWCCSN2（利用行波离子迁移率和氮缓冲气体生成的CCS值）值，从而明确识别标记物类黄酮异构体（6-C和8-C糖基黄酮异构体对orientin（187.7？2）/isoorientin？（198.1？2）和vitexin？（195.5？2）/isovitexin（188.8？2））[25]。与西番莲复合叶提取物中的结构相关分析物相结合，测定的异定向素和定向素的保留时间相差0.05分钟，异牡荆素/牡荆苷的保留时间差别0.12分钟。在分析的西番莲提取物中，异定向素和定向素的浓度使它们合并形成一个色谱峰。仅使用精确的质量测量，这些共溶标记异构体将无法区分，但使用IMS和优化的UPLC条件，两个关键异构体对都得到了解析（见图7）[25]。图6所示的同分异构体产物离子光谱是由图7所示的IM解析的色谱共溶性orientin和isoorientin异构体生成的，仅通过质量分辨率是无法实现的。利用HDMSE，“碎片离子”由特定保留时间/漂移时间校准的前体离子生成，因此被称为产物离子[26,27]。之前已经描述过使用离子迁移率质谱法对西番莲属物种进行详细分析[25]。

CCS值还可以增加“已知-未知”分析物以及“已知”分析物的识别确定性。UPLC-IM-CID-MS非靶向特异性，即CCS测量和独特的产品离子光谱使未知身份的异构体被归类为6-C或8-C糖苷[25]。结合保留时间、CCS和准确的质量测量（前体和产物离子），“已知-未知”增强了特异性，以促进鉴定分析并生成西番莲属物种变异图谱，尽管可能不知道每个成分在分子方面的精确性质。增加了覆盖面和特异性，其中255对异构体对被离子迁移分离，86%的这些成分仅在西番莲变种中检测到。在没有高纯度参考标准或价格昂贵的情况下，该方法是有益的。图8显示了[M-H]-M/z 577.1563异构体（C27H30O14）通过保留时间和漂移时间分离的物种变异曲线示例。识别“已知/未知”并重新分配给“已知”可以在不依赖分析标准的情况下实现，并在其他地方进行了详细描述[19]。类黄酮CCS库可以扩展，其中实验CCS信息与CCS预测值进行了比较，相应的结构产物离子信息与历史剖面信息进行了比较。该策略已用于将“已知-未知”异构体重新设计为“已知”异构体，并扩展已知西番莲属物种指纹。

结论

UPLC-IM-MS是在非靶向数据独立筛选分析中实现靶向特异性的途径。对四种西番莲属植物的植物化学特征进行了描述，说明了数据依赖性分析在描述药用植物物种和复杂分析本身方面的演变。使用四个识别点实现多因素识别置信度，包括前体离子/产品离子准确质量、保留时间和CCS测量。与精确的质量测量、保留时间、CCS测量一样，可以无缝生成，从而为样品中的所有成分提供额外的特异性增强描述符。

有利于“全扫描”UPLC-IM-MS的组合分离。数据相关的HDMSE采集有助于生成类似于MS/MS的数据，生成样品中所有成分的净化前体/产品离子光谱。无需设置目标采集，也无需事先了解样本成分。

使用四个累积指标前驱离子m/z、产物离子m/z，tr和CCS；创建了一个高度特异（非靶向）的“已知-未知”物种依赖指纹，用于植物化学分析。使用了大量的信息，而这些信息通常是多余的。额外分析物“未知”、“未知”异构体的信息用于填充“已知-未知”数据库。该策略用于扩展和增强物种形成概况，而无需确定所有物种组成。CCS预测算法已经发展并用于识别“已知-未知”，将其分配转化为“已知”。在这项研究中，使用UPLC-IM-MS提高了覆盖率和物种特异性，其中检测到255对离子迁移率分离的“已知-未知”异构体对，其中86%是西番莲变种特有的。复杂样品分析的特异性是通过“已知”和“已知-未知”分析获得的。

使用tr、m/z和IM漂移时间的常规三维分辨率用于分离、共溶等压和异构组分。IM当然提供了与UPLC（疏水性）正交的分离（基于尺寸、电荷和形状）。仅使用精确质量无法实现，色谱共溶标记异构体已使用CCS进行区分，并实现了不同正/负异构体产物离子比的分离。

UPLC为分析提供了66%的时间效率增益和更大的峰值容量。高分辨率质谱通常用于20000-50000 FWHM以上。这些分辨率增强功能通过增强数据独立采集的特异性提供了分析灵活性。此外，由于信息学的进步和CCS识别点的合并，目标数据处理效率也随之提高[27]。