长春应化所姜秀娥研究员 Angew: 受博弈论启发 - 谷胱甘肽介导纳米颗粒原位迈克尔加成用于引发焦亡和抗肿瘤免疫治疗

复杂的肿瘤组织中的癌细胞之间不仅通过彼此竞争以获取有限的资源，而且还会为肿瘤的生长彼此合作以与健康细胞作斗争。此外，在进化动力学的推动下，肿瘤组织表现出多种适应性反应，包括抗氧化分子的过表达、免疫抑制、不同分子之间以及癌细胞与免疫细胞之间彼此合作以利于肿瘤生长等等。如何打破肿瘤组织中这种复杂的竞争与合作关系成为了一种挑战。博弈论描述了如何通过引入竞争对手来促进内部竞争，削弱他们的合作并最终使其崩溃，从而在平等的竞争中实现获胜的目标。

近日，中国科学院长春应用化学研究所姜秀娥研究员及其团队发表了题为“Inspired by Game Theory: Glutathione-induced in Situ Michael Addition between Nanoparticles for Pyroptosis and Immunotherapy”的文章（DOI: 10.1002/ange.202301866）。为了设计出可以打破肿瘤组织中复杂的竞争与合作关系的纳米药物，该课题组以“进化博弈论”作为概念指导，该课题组提出将肿瘤看做一个系统，所引入的新的竞争者就是BEM NPs，对手方即为肿瘤组织，通过设计纳米药物来争夺对肿瘤生存敏感和/或有益的分子(如:抗氧化分子)，从而使肿瘤系统内部的合作关系崩溃，使肿瘤微环境中发生长期且剧烈的变化并引发后续的免疫反应，最终打破肿瘤的进化适应性，实现有效的肿瘤治疗。该团队通过生物矿化的方法制备了含有氧化型(−)-表没食子儿茶素-3-邻没食子酸酯(EGCG)和多金属氧酸盐结构的EGCG-钼离子配位纳米颗粒(BEM NPs)用于诱导癌细胞焦亡并激活抗肿瘤免疫反应（图1）。

图1. BEM NPs的治疗机制示意图

EGCG是茶多酚中最重要的成分之一，可以通过影响酶功能、抑制信号转导、增强细胞凋亡等途径显示出巨大的抗癌潜力。由于其具有较高的生物相容性并拥有很多功能基团，它经常被制备为纳米颗粒并用于生物医疗领域。该团队发现EGCG分子氧化后所形成的醌可以同时与谷胱甘肽(谷胱甘肽)的氨基和巯基发生Michael Addition反应，这是一种竞争谷胱甘肽的新策略。基于这一发现，其团队通过生物矿化的方法制备了含有氧化型EGCG和多金属氧酸盐结构的EGCG-钼离子配位纳米颗粒(BEM NPs)。当BEM NPs被癌细胞内吞后，它们可以通过Michael Addition反应消耗癌细胞中过表达的谷胱甘肽，将它们从纳米点转变为大的聚集体(图2)，并显著降低谷胱甘肽的含量。

图2.(a)醌与谷胱甘肽反应示意图。(b) BEM NPs的制备示意图。(c)BEM NPs的TEM图。（d）GSH与BEM NPs反应后的TEM图。（e）GSH与BEM NPs反应前后水合粒径的变化情况。

同时Mo和多金属氧酸盐结构的存在使其可以通过类Fenton反应和罗素机制提高细胞内的活性氧水平，从而破坏癌细胞的氧化还原平衡。我们利用生物透射电镜(Bio-TEM)观察到溶酶体中明显聚集，溶酶体膜和质膜被破坏，诱导细胞焦亡和免疫原性细胞死亡，促炎细胞因子的分泌:白介素1β (IL-1β)在BEM NPs处理组的表达明显增强，释放损伤相关分子模式(CRT、ATP和HMGB1)，暴露在外的CRT可以作为“吃掉我”的信号，刺激DC吞噬垂死细胞的碎片。高水平的ATP和释放的HMGB1可以进一步促进DC进入肿瘤床，并允许宿主DC分别处理和呈递肿瘤抗原。通过流式细胞术量化DCs的成熟程度。BEM组DCs成熟的数量更多。同时，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测炎症因子的分泌情况。结果显示，BEM NPs处理组，白细胞介素10 (IL-10，免疫抑制细胞因子)含量降低，而全身白细胞介素12p70 (IL-12p70)、白细胞介素6 (IL-6，促炎细胞因子)、肿瘤坏死因子α (TNF-α)等细胞因子分泌水平明显升高。这也表明BEM NPs可以调节癌细胞与免疫细胞之间的相互作用，增强抗肿瘤免疫应答(图3)。

图3. (a) 经过不同NPs孵育12 h后4T1细胞的形态变化。白色箭头表示从质膜上吹出的大气泡。(b) 4T1细胞与BEM NPs孵育12小时前后的Bio-TEM图。“M”代表线粒体，“L”代表溶酶体，“N”代表细胞核。(c) NPs孵育12 h后4T1细胞中谷胱甘肽含量的变化。用SOSG (d)或HPF (e)染色并经NPs处理的4T1细胞的CLSM成像。（f）caspase-3/7 (f)，Fluorescein-dUTP (g)，caspase-1（h）和CRT（k）的表达情况。(i)用NPs孵育24 h后4T1细胞的活力。(j)用ELISA法检测处理后4T1细胞悬液中IL-1β的分泌情况。ATP (l)和HMGB1 (m)释放量。(n) 流式细胞术分析DC细胞的成熟情况。ELISA法检测不同组别中DCs细胞悬液内IL-10 (o)、il - 6 (p)、IL-12p70 (q)和TNF-α (r)的分泌情况。

图4. (a)治疗后第6天IL-10、IL-6、IL-12p70和TNF-α含量的变化情况。(b)DC细胞成熟情况分析。经过不同治疗后辅助T细胞比率(c)与毒性T细胞比率(d)的变化情况。经过不同治疗后肿瘤组织辅助T细胞(e)、细胞毒性T淋巴细胞(f)，颗粒酶B(g)和穿孔素（f）水平。经过不同治疗后原发肿瘤(h)和远端肿瘤(i)体积变化情况。

最终该纳米药物与免疫检查点阻断剂(anti-CTLA4)结合后，腹股沟淋巴结中成熟DCs的比例显著升高，其通过调节T细胞增殖进一步介导下游免疫应答生成的辅助T细胞和毒性T细胞将通过流出淋巴管离开淋巴结，进入血液，并迁移到肿瘤部位的周围，并且，颗粒酶B与穿孔素等效应分子的含量也显著增多，进一步促进了对癌细胞的杀伤作用(图4)。

该研究在“博弈论”的启发下，通过向肿瘤引入竞争对手(纳米制剂)，打破了肿瘤系统中的合作，结果成功地证明了BEM NPs出对肿瘤的有效抑制。

论文信息

Inspired by Game Theory: Glutathione-induced in Situ Michael Addition between Nanoparticles for Pyroptosis and Immunotherapy，Angewandte Chemie International Edition DOI: 10.1002/ange.202301866