高通量液相色谱进样的注意事项

介绍

近年来，超快液相色谱技术在减少分析时间和增加分析吞吐量方面的应用得到了极大的发展。能够提供更高压力和流速的仪器，再加上现代色谱柱技术，即使在很短的长度上也能提供足够的色谱效率，为大幅提高分离速度提供了手段。探测器模块的改进和新的数据处理算法使得能够以必要的速率有效地采集信号。自动取样器的操作速度也有所提高，但落后于其他进步，现在是进一步提高LC中样品吞吐量的主要瓶颈之一[1]。在本综述中，将讨论当前的注射器和自动取样器技术，以及用于减少注射周期时间的最新策略，以及如何在未来几年进一步发展这些策略。

自动取样器操作和注入

在色谱数据系统（CDS）内建立的典型方法序列中，列出了一系列运行，详细说明了要对哪个小瓶进行取样以及每次注射要使用哪个色谱方法。在标准仪器操作模式下，自动进样器序列在每次进样之前发生。该顺序通常包括将针头移动到指定的样品瓶位置、抽取样品、移动回注射阀（如果使用针座端口）以及一系列针头清洗以减少样品夹带[2,3]。这种方法有多种限制，可能会增加仪器循环时间，从而降低整体分析吞吐量。主要问题是自动进样器序列和色谱运行是异步进行的，这意味着总仪器循环时间是这两个操作时间的总和，而不仅仅是两者中较慢的一个。解决这一限制的简单方法是，在前面的色谱运行中同时执行自动进样器序列，以便在完成一次色谱分析后，可以立即开始下一次分析，因为样品已经送到注射器。此类功能通常可用作现代CDS的设置，使用自动取样器控制代码中的“PrepareNextInjection”[4]、“Enable Overlapped Injection（启用重叠注入）”[5]或“Prep Ahead”[6]等功能。该方法用于分析非处方（OTC）止痛药化合物，完整的色谱循环时间为20 s（15次重复运行的总分析时间为5 min）[7]。通过以1.3 mL/min的速度操作2.1 x 50 mm填充有亚3µm核壳颗粒的色谱柱，实现了较短的分离时间，当色谱柱压力超过750 bar时，这需要UHPLC仪器。通过限制针洗过程的时间，自动取样器序列时间减少到13秒以下，这确保了它可以在前20秒色谱运行结束之前完成（图1）。尽管在本例中未观察到携带物的重大问题，但这可能会成为一个问题，取决于特定分析物和样品溶剂与自动进样针和自动进样环接触。为了证明一种更可靠、合格的高通量OTC止痛药分析，结合等效的分离时间和约30 s的自动取样序列（包括洗针），实现了40 s的循环时间[8]。

在上一段所述的两个例子中都使用了种族隔离。随着自动进样器和色谱分析的同步运行，首要问题是确保没有阀门驱动步骤与洗脱峰一致。这种驱动可能导致压力变化，从而导致探测器信号中断，并使观察到的峰值形状发生畸变。当在低循环时间分析中使用快速（或“弹道”）梯度分离时，系统驻留体积是另一个关键考虑因素，因为它影响编程梯度到达色谱柱所需的时间[9]。泵和喷油器之间的连接（可能包括直列式混合器）、喷油器内部的流动路径以及与色谱柱的其他连接都会产生此值。不流过针阀的自动取样器配置通常提供较小的体积，更适合高通量梯度法，尽管其设计可能会在注射器流道中形成气泡[3]。

同步注射循环样品制备的一个变化是单次实验运行中的多次注射（MISER）技术[10]。在MISER中，多次进样以上述相同的方式进行，但数据不是作为单个色谱图收集的，而是收集在单个数据文件中。这是一种理想的定性工作策略，通过快速比较注入序列中的一系列运行，可以快速识别样本集中的一般趋势和异常值（即高丰度和低丰度峰值）。例如，MISER已被用于快速比较不同品种啤酒中啤酒花衍生成分的数量[11]、饮料中咖啡因的浓度[12]以及辣椒和辣酱中辣椒素的含量[13]。这也是制药行业中对映体纯度监测和其他高通量筛选需求的一个强大战略[1，14]。MISER的主要缺点是，与收集每个独特运行的单个色谱图相比，峰值量化的难度增加。许多用于定量的软件算法在特定保留时间（和/或m/z值，取决于检测模式）使用分析物和内标峰之间的面积比较，当多个单独的分离都绘制在单个色谱图上时，这可能更难合并。虽然仍然可以通过色谱图拆分程序[9]或手动处理来实现，但这些策略需要更多的用户交互，以确保所有峰都正确匹配；在高通量筛选实验中，随着运行次数的增加，总体工作量显著增加。因此，重要的是要考虑正在进行的高通量实验的总体目的，更具体地说，是定性还是定量，以便确定哪种方法最适合缩短周期时间。

同步自动进样器循环方法的一个改进版本是在前一次运行期间实际注入后续样品，而不是仅仅准备注入。在制备级HPLC或SFC中进行手性纯化时，通常使用这种方法。当使用等度洗脱条件且峰洗脱窗口相对于总峰洗脱时间较短时，层叠进样减少溶剂消耗并提高生产率[15]。该方法对非保留色谱模式（即尺寸排除色谱、流体动力色谱）也有效[16,17]，其中峰的有限洗脱窗口是基于给定固定相尺寸范围的高低端分析物之间的体积差异而已知的。由于样品进样和第一个洗脱峰之间的初始延迟，可以在此时间间隔内进行额外进样，以便第二次进样的相同第一个峰与初始样品的最终峰紧密洗脱。这在用于减少二氧化硅填充材料粒度分布的制备级流体动力色谱分离中得到了证明[18,19]。由于需要多次注射才能获得所需的纯化样品量，因此该策略消除了将样品输送至注射回路所需的运行间隔时间的增加[20]（图2）。对于单克隆抗体的聚集特性，也描述了类似的方法[21,22]。尽管这些示例包括稍长的运行时间，并且所增加的时间仅为总循环时间的一小部分，但该技术将对基于规模的高通量分离产生影响[23]。对于含有更复杂混合物的保留色谱模式，已经开发了类似的流程，但由于需要优化以避免峰共洗脱，因此实施起来可能更加困难[24]。在这些情况下，可以首选前面描述的策略。

考虑与喷油器相关的加宽效应

使用较小尺寸的色谱柱以及体积，使得基于仪器的展宽效应成为高通量液相色谱的一个关键方面。由于注入循环而产生的展宽的最基本描述仅基于注入样品的体积[25]：

(1)

然而，这是一种简化，它假定了矩形注入带剖面，并不是对注入过程导致的实际展宽的真实估计[26]。许多研究已经确定了注射过程中加宽的其他原因，其中许多原因与流量有关，并可能随着分离速度的增加而增加。在一个实验中，在一个纳米体积的内环设计中，使用一个小型化的电化学检测器来跟踪注射器带剖面，该内环设计耦合了各种管径和长度。确定洗脱峰包含高斯和指数成分，其指数成分随着流速的增加而增加（图3）[27]。这种加宽的可能原因是定子、转子和连接管之间的通道直径突然变化，每个通道失配都会产生一个“混合室”。通过对喷油器流动路径的计算重建进行流体动力学建模，进一步支持了这一实验观察。为了减少这种展宽贡献，可以通过执行部分回路“定时夹送注射”，将峰值的尾部从注射剖面中移除，注射后快速驱动阀门回到“负载”位置（图3），尽管与传统的全回路注入相比，这会降低注入的重复性[27]。

还对分析规模系统中的商用自动采样器进行了研究，以确定注射引起的展宽效应。在针座和注射器之间包含毛细管连接的系统中（通流针头设计常见），较小直径的管道对于最小化加宽至关重要[25,28]。随着流速的增加，基于注射器的加宽也显著增加，稳定在0.8 mL/min左右[28]。对于与上一段中研究的喷射器更为相似的基于回路的喷射器，喷射体积和流速对观察到的加宽的影响均低于直通式针阀喷射器。然而，随着内径环的增大，在高流速下也观察到了这种形式的额外贡献[28]。流体动力学模型也用于进一步探索这些观察结果，并确定了喷射器内存在两种状态：对流状态和扩散状态[29]。主要制度取决于许多变量，包括注射体积、针头直径（特别是流通针头）、分析物扩散系数和色谱流速。在用于色谱分析的典型LC操作条件下，环形注射器产生的注射带比流通设计窄[29]。这些不同的研究都表明，注入导致的频带展宽贡献通常被低估，并且在高通量LC中使用的较高流速下，这种展宽通常会增加。因此，仍需进一步优化通道结构和整体注射器设计，以确保快速液相色谱分离中的高色谱性能。

高通量样品注入的潜在方向

如上所述，现代注射工艺得到了显著改进，最快的自动进样器循环时间现已降至7秒[17]。然而，随着超快速亚秒分离变得更加可行[30]，与目前每秒可超过30个样本的基于MS的技术相比，7s仍太慢，无法实现高通量筛选率[31]。一种方法是使用并行采样，将多个样本同时引入流[32]。在某种程度上，这已经被纳入到包含双针设计的现代自动采样器中[33，34]，尽管这种复合方法需要大幅增加以适应更快速的分离。Pittcon 2020的一次演示中描述了在多路阵列中使用分段液滴进一步提高样品吞吐量的潜力[35]。迄今为止，当将液滴耦合到分离技术时，所获得的最高分析率依赖于微芯片电泳[36、37、38]，因为有许多成功的方法可以将液滴流注入电泳分离通道[39]。对于压力驱动的液相色谱分离，这一过程可能更具挑战性。采用天鹅探针法从空间液滴阵列中收集样品，并将其输送至在线整体柱[40]，尽管它依赖于通道密封技术，该技术将工作压力限制在25巴，且速度不比最先进的商用LC自动取样器快。在包括在线LC-MS分析的反应优化平台中，用惰性气体分割的液滴流直接耦合到注入回路，该回路带有一个额外的真空端口，用于清除回路中的剩余液体并减少携带[41]。后一种技术可能具有提高吞吐量的最佳能力，但关键是要精确定时阀门驱动，以便只注入样品，而不注入载体相。如果液滴被惰性气体分割，这可能只会导致小问题，但如果使用可能干扰分离和/或导致携带问题的氟化油，则可能会更加有害。

随着对依赖色谱分离的快速筛选方法的需求不断增加，必须检查分析技术各个方面的速度。采用更高吞吐量样本引入的新策略将是下一代快速测量工具的一个关键方面。下一代样品注射是否基于平行取样、分段流动或其他技术尚待确定，大多数超快色谱从业人员都认为这是一个需要克服的主要瓶颈。目前，使自动采样器循环时间低于10秒的进步仍然代表着与前几代仪器相比的显著进步，并且仍然可以在几乎所有依赖LC的实验室中促进更高的吞吐量分析。