高效液相色谱/二极管阵列检测/质谱法筛选补充保健品中的西药掺伪品

气相色谱/质谱（GC/MS）和高效液相色谱/二极管阵列检测（HPLC/DAD）是用于筛选补充保健品中大多数常见西药掺假品的技术。然而，在复杂的样品基质中，通常观察到共洗脱和基线分离较差的峰，因此对识别任何可疑药物都构成了挑战。因此，我们认为需要开发一种基于分子离子检测、紫外（UV）光谱和每种药物保留时间的高效液相色谱/二极管阵列检测/质谱（HPLC/DAD/MS）筛选方法。该方法已成功用于213种药物及其各自的检测限（LOD）。还成功构建了包含200多种药物的室内UV文库和室内MS文库，并将其用于补充健康产品中西药掺假物的HPLC/DAD/MS筛选。

1.简介

在新加坡，补充健康产品通常包括中成药、传统药物和保健品。这些产品广泛用于维持或改善健康，公众认为补充健康产品是安全的，没有副作用[1]。补充健康产品最大的安全问题之一是在非法企图逃避检测的情况下掺入未申报的药物及其类似物[2,3,4]。它代表了产品质量问题，是不良事件的主要原因之一[5]。

在补充保健品中筛选西药掺假品的最常用技术是气相色谱/质谱（GC/MS）和高效液相色谱/二极管阵列检测（HPLC/DAD）[6,7]。然而，HPLC/DAD筛选方法通常会遇到共洗脱的问题，尤其是对于复杂的样品基质，峰的基线分离较差，因此对识别任何可疑药物都提出了挑战。

由于其良好的灵敏度和选择性，液相色谱/质谱（LC/MS）方法也被用于保健品的筛选[8,9,10]。由于健康补充剂具有复杂的基质，LC/MS将是一种更合适的筛选技术，因为它具有高度的选择性，能够提供有关药物分子量的额外信息。高效液相色谱法结合二极管阵列检测和电喷雾电离质谱（HPLC/DAD/MS）可以潜在地消除假阴性结果，提高筛选能力。一些报告侧重于通过HPLC/DAD/MS筛选数量有限的西药掺假品[9,11]。到目前为止，还没有报道用HPLC/DAD/MS同时筛查补充健康产品中广泛的西药掺假品。因此，需要开发一种特定的方法，可以同时筛查补充健康产品中的多种西药掺假品。

在本研究中，建立了HPLC/DAD/MS方法，作为一种基于检测分子离子、紫外（UV）光谱和每种药物在一次运行中的保留时间的基础上筛选补充健康产品中多种西药掺假物的方法。还成功建立了一个内部UV库和内部MS库，并用于筛选补充健康产品中的西药掺假品。

2.实验

2.1材料

使用的大多数标准药物（150种药物）均购自美国药典（马里兰州罗克维尔）、英国药典（英国米德尔塞克斯郡特丁顿）或欧洲药典（法国斯特拉斯堡）。其余63种二级标准药物从TLC制药标准有限公司（加拿大安大略省奥罗拉市）或Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯市）获得。所有213份标准品均在甲醇中制备，以达到1 mg/mL的浓度。然后使用甲醇将其进一步稀释至0.1 mg/mL，以注入HPLC/DAD/MS系统。

2.2 HPLC/DAD/MS筛选

使用安捷伦1260系列Infinity II HPLC色谱仪（带二极管阵列检测器）和单四极杆质谱检测器（MSD）6135B（带电喷雾电离（ESI））（德国沃尔德布隆）进行分析。所使用的色谱柱为Thermo Scientific Accucore C18，150 mm x 2.1 mm，2.6µm（宾夕法尼亚州，美国）。在色谱运行期间，在线记录200至400 nm的紫外光谱。质谱是在m/z 100到1000的质量范围内获得的。方法条件如表1所示。

2.3样品制备

研究中选择的十种补充健康产品是胶囊、颗粒、药丸、粉末和液体。打开胶囊并将其内容物用于分析。使用前将颗粒和药丸磨碎。粉末和液体样品直接用于分析。试验前，所有样品均已彻底均质。将约1g用选定的西药掺假物预先注射过的匀浆样品转移到试管中，并添加10mL甲醇。在超声波浴中对混合物进行超声波处理15分钟，并使用0.45µm PTFE膜过滤器进行过滤，该过滤器已经过验证，没有吸附作用

HPLC/DAD/MS分析。

3.结果和讨论

3.1 UV和MS库的开发

使用DAD获得213种标准药物的UV光谱，并使用OpenLAB CDS ChemStation数据分析软件（安捷伦科技公司）将其编译为UV库。使用相同的软件通过图书馆搜索对补充健康产品中的药物进行筛选。与未知样品中的峰对应的紫外光谱与库中的光谱进行了比较。自动计算每个峰的紫外光谱库匹配，1000分表示完美匹配，900分以下表示较差匹配[12]。库匹配高于950的峰值识别结果可以被视为具有良好确定性的识别。对于LC/DAD库搜索，保留时间窗口设置为±20%，匹配阈值设置为900。对于那些与室内文库建议的原料药保留时间相近（±1 min）且文库匹配≥900的峰，这些峰的紫外光谱将与文库中参考原料药的紫外谱相匹配，以确定是否存在任何掺假物。

使用单四极杆质谱仪获得213种标准药物的质谱。使用Microsoft Access将213种药物的分子离子质量电荷比（m/z）和保留时间编译为MS库。使用我们的in-house开发的程序“MS library search Report Generator”，将保留时间窗口设置为±1 min，离子质量窗口设置为？.2 Da，通过库搜索对补充健康产品中的药物进行筛选。将未知样品中的峰对应的m/z和保留时间与文库中的峰进行了比较。每个峰值都会自动计算库匹配，100分代表完美匹配。对于那些保留时间接近（±1 min）且m/z在±0.2 Da范围内的峰，这些峰与室内LCMS库建议的参考药物相比，将被列为可疑掺假物。

表2显示了UV和MS库中213种药物的药物名称、保留时间、分子离子和检测限（LOD）。

两种或两种以上化合物的共溶仍然是HPLC/DAD筛选方法错误的主要原因之一。因此，内部UV文库和内部MS文库的开发将在HPLC/DAD/MS筛选补充健康产品中的西药掺假物方面非常有用，因为MS是一种比DAD更具选择性的技术。

3.2补品中西药掺假品的筛选

为了验证HPLC/DAD/MS筛选系统，选择了两个阳性样品（每个样品含有一种药物）和八个阴性补充健康产品样品矩阵。共有14种药物被添加到8种阴性补充健康产品样本矩阵中作为未知药物。表3显示了阳性样品中检测到的药物列表（产品1和2），以及阴性样品中药物峰值浓度的列表（产品3-5、7-8和10）。有两个阴性样品没有任何药物被添加（产品6和9）。然后使用HPLC/DAD/MS筛选系统对所有十个样品进行分析，结果如表3所示。LC/DAD文库检索报告能够成功检测和识别16种药物中的14种，文库匹配分数超过990，表明UV光谱与UV文库中的药物匹配良好。LC/DAD文库检索报告未检测到两种药物，即产品4中的吡罗昔康和产品7中的羟基莫西地那非，因为它们在相同的保留时间内与其他峰共洗脱。然而，当MS技术用于筛选时，在LC/MS文库检索报告中成功检测到产品4中的吡罗昔康和产品7中的羟基西地那非，并以100分的满分进行鉴定。

为便于说明，将两种药物，即去甲基西地那非和羟基西地那菲，如图1A所示，在约10.8 min的时间内具有紧密的保留时间，以及如图1B所示的相同UV光谱，以10 mg/L的浓度添加到产品7中。如图1D所示，LC/DAD文库搜索报告无法识别羟基莫西地那非。图1C中m/z 461.1的存在表示去甲基西地那非的分子离子[m H]，而

图1C中m/z 505.1处的离子对应于羟基西地那非的分子离子[m H]。由于质谱中观察到m/z 461.1和501.1的两种分子离子，这表明两种药物都存在于产品7中。LC/MS文库检索报告能够以良好的匹配质量正确识别去甲基西地那非和羟基西地那菲，如图1E所示，即使这两种药物在相同的保留时间以相同的UV光谱共同洗脱。HPLC/DAD/MS筛选方法在十份样品中的所有十六种药物的鉴定中证明是成功的

这项研究

检测限（LOD）被确定为最低浓度，在此浓度下，紫外检测的信噪比（S/N）至少为3。213种药物的检测限（LOD）确定为5至100 mg/L，如表2所示。121种药物的最低LOD为5 mg/L。肼屈嗪和东莨菪碱N-丁基溴的LOD最高，为100 mg/L。213种药物中的大多数LOD（92%）在5–20 mg/L范围内，这被认为是筛选掺假药物的合理限制。

由于补充健康产品中基质的复杂性，以及基质和药物化合物的共同洗脱，药物的紫外光谱无法与紫外筛选库中药物的紫外光谱匹配，导致假阴性结果。因此，使用基于分子离子检测的高选择性LC/MS筛选技术来补充DAD技术非常重要，从而避免假阴性结果。

还需要一个良好的数据处理软件程序来筛选补充保健品中的西药掺假品，以便对内部紫外线和MS筛查库进行自动血清学搜索。OpenLAB CDS ChemStation Data Analysis软件可以在匹配中包含保留时间的情况下，对UV库进行自动库搜索，但MS库不具备这种自动库搜索功能。最好有一个强大的数据处理软件套件，可以在同一份报告中同时生成UV和MS库搜索结果，这可以大大简化数据处理和解释。

4.结论

新开发的HPLC/DAD/MS筛选方法已成功用于213种药物，以及它们在补充健康产品基质中的检测限（LOD）。这项研究证明了使用内部UV和MS库对213种药物进行有效筛选和鉴定，而无需为每次分析制定标准。