Nat. Biomed. Eng.：自组装的超分子系统缓释递送河豚毒素实现长效局部麻醉

前言

通过提高患者的舒适感和减少对阿片类药物的依赖，提供长时间局部麻醉的制剂对疼痛管理具有重要影响。为了尽可能满足这种需求，研究人员对开发药物递送系统来延长局部麻醉作用的持续时间产生了极大的兴趣。河豚毒素，一种位点 1 钠通道阻滞剂 (S1SCB) ，作为局部麻醉剂很有吸引力，因为它们具有很强的效力，而且它们不会引起传统氨基酰胺和氨基酯局部麻醉剂所见的局部神经毒性和肌肉毒性。

然而，它们的全身毒性可能很严重，而且它们的治疗指数很窄。因此，利用载体控制它们的释放以延长作用持续时间和最小化毒性是很重要的。但是河豚毒素极易溶于水，这意味着即使被封装在载体里面，它们也往往在进入体内后溶解于周围的水中。S1SCB的亲水性使其封装变得极具挑战性。

国家纳米科学中心季天骄研究员课题组与哈佛医学院DanielS. Kohane课题组最近在Nature Biomedical Engineering上发表题为“Delivery of local anaesthetics by a self-assembled supramolecular system mimicking their interactions with a sodium channel”的研究工作，受到S1SCBs与钠通道上的两个肽序列的特异性相互作用的启发，他们设计了一种针对S1SCBs的自组装递送系统，通过超分子相互作用模拟分子结合位点的策略，成功地缓释递送河豚毒素。

原文链接

https://doi.org/10.1038/s41551-021-00793-y

主要内容

图1 S1SCBs和肽的选择

首先，研究人员假设两种S1SCBs：河豚毒素（TTX）和蛤蜊毒素（STX），对钠通道上的特定结合位点有亲和力，这种亲和力可以用来创建一个缓释系统。为了创建缓释系统，研究人员选择了两个关键的肽序列P1(TQDYWEN)和P2(CGEWIET)，研究了这两者的混合物(称为P1P2)是否可以特异性地与TTX相互作用结合。

两种肽都是实际钠离子通道的一部分。实验结果表明：该系统没有形成纳米结构，说明P1、P2和TTX之间的距离过长，无法产生有效的超分子相互作用。在天然钠通道中，TTX通过氢键和静电作用等与P1和P2序列相互作用，其距离小于5Å。

图2 TTX与MPs的结合示意图以及具有不同疏水结构域的MPs

研究人员进一步假设，将P1和P2更紧密地结合在一起将有助于与TTX的相互作用，并可以通过用疏水结构域修饰它们来实现接近，修饰后的肽（P1修饰后记为MP1，P2修饰后记为MP2）将自组装成纳米结构。

由于疏水结构域所占的比重会对自组装产生影响，研究人员选择所有氨基酸中分子量最小的甘氨酸(G)作为连接单元，设计了在氨基端具有不同疏水结构域修饰的多肽。选择的疏水结构域为十二烷酸（C12）和十八烷酸（C18）以及由疏水氨基酸组成的两种多肽Benz-FFFLL和Benz-YFYLL。所得到的多肽分别命名为C12-Pn、C18-Pn、ϕFFF-Pn和ϕYFY-Pn（n=1或2，对应于P1或P2的修饰）。

图3 TEM表征、缓释实验以及圆二色性光谱表征

通过TEM表征发现，所有四种MP对都形成了纳米纤维，并且纳米纤维的宽度不受添加TTX的影响。进一步的实验发现，只有ϕFFF-P1P2和ϕYFY-P1P2能够使TTX持续释放（它们的宽度与C18-P1P2相当）。这说明纳米纤维的宽度在纳米纤维与TTX的相互作用中并没有起到关键作用。

另外，研究人员通过补充实验证明P1和P2的存在在纳米纤维与TTX的相互作用中都很重要。在MP组装体中，P1和P2序列本身之间的相互作用（如氢键和静电相互作用）可能会干扰与TTX的结合，从而控制其释放的能力。为此，研究人员利用圆二色性(CD)光谱研究了不同的肽对之间的相互作用。通过CD光谱发现，C12-P1P2和C18-P1P2中P1和P2之间的相互作用较大，可能阻碍了与TTX的相互作用，这也许可以解释了为什么它们不能控制TTX的释放。

图4 TAMCP和MP对TTX的竞争结合示意图

研究人员采用竞争性结合试验，进一步评估了TTX和MPs之间相互作用的特异性。在TTX酶联免疫吸附剂测定法（ELISA）检测中，如果测试样本不包含TTX，一抗将识别并结合该蛋白质，然后二抗和着色剂将与一抗结合，产生深色；

当TTX存在时，它会与TTX类似物修饰的载体蛋白（TAMCP）特异性结合，产生浅色；如果将肽溶液(P1P2、ϕFFF-P1P2和ϕYFY-P1P2)添加到ELISA反应中并与TTX结合，更多的抗原将是游离的，从而产生更多的颜色。

图5 活体动物模型实验

最后，作者在坐骨神经阻滞的大鼠模型中，评估了这些制剂延长体内神经阻滞持续时间的能力。单独使用TTX的神经阻滞的持续时间随着剂量的增加而增加，但毒性却变成了剂量限制。使用P1P2+TTX或含有谷氨酸的多肽变为谷氨酰胺（ϕFFF-MuQP1P2+TTX），并没有改善神经阻滞或毒性。然而，当TTX在ϕFFF-P1P2+TTX中递送时，神经阻滞的持续时间明显延长（15.9 ± 1.3 h）。

表1 TTX 制剂在大鼠坐骨神经阻滞中的功效

本文由国家纳米科学中心季天骄课题组研究生熊伟进行校对，对此稿亦有贡献。