UHPLC-MS/MS评价混合模式离子交换SPE从人尿中提取类阿片

背景

任何固相萃取（SPE）或样品制备方法开发的目标都是获得最佳分析物回收率，同时将到达最终分析样品的污染化合物浓度降至最低。传统的松散填充SPE产品容易受到各种技术问题的影响，这些问题是由树脂在滤芯中的不良包装引起的。在方法开发过程中，不一致的包装可能会产生问题，导致空隙和通道化，从而增加获得较差分析物回收率的风险。

微琴TM CP SPE系列消除了制造过程中的松散包装，因此克服了样品制备过程中经常遇到的这些技术问题。相反，它由一种独特的固体混合聚合物结构组成，该结构由均匀分布的孔隙相互连接的网络组成，孔隙被固定在保留介质中。这种设计增强了样品的流通性，以最大限度地提高分析物和固相之间的相互作用，从而提供高度重复性

SPE方法

本申请描述了使用强阳离子交换（SCX）SPE 30 mg 96孔微孔板的SPE LC-MS/MS方法，用于测定人类尿液中的12种阿片类物质。它还考察了混合聚合物产品与松散填料板相比的性能优势。

介绍

阿片类药物危机

阿片类药物被视为一些最有效的止痛药物，并被归类为减少患者痛苦的重要部分[1]。由于其在缓解疼痛方面的有效性，这类药物因其用于娱乐目的而引起了很多争议。这导致了它们的正常使用，导致了全世界范围内广泛的毒瘾和滥用。据估计，2017年欧洲有130万高风险使用者[2]，2018年美国有1030万12岁或以上的人滥用类阿片[3]。

随着类阿片滥用的增加，实验室测试类阿片的存在变得更加重要，以帮助检测患者滥用类阿片，同时仍然允许其他患者获得他们需要的疼痛缓解。实验室测试在帮助解决美国的类阿片危机方面发挥着关键作用。Quest diagnostics（美国一家大型国家临床实验室）分析了2011-2017年的药物检测数据，其中包含390万个未经确认的药物监测测试。该报告发现，从2011年至2017年，每年进行的大多数测试都被归类为与规定数量的预期结果不一致[4]。因此，从这些结果可以得出结论，需要进行测试以确认患者是否滥用处方或在处方中使用其他非法药物。如果患者按照规定使用阿片类药物或无视他们的计划并导致滥用，则可以通过尿液色谱法进行最终验证[5]。

阿片类药物的检测

目前有两种测试用于检测尿液中的类阿片：免疫分析筛选测试和色谱测试。标准类阿片免疫分析通常用于检测天然吗啡类分子（吗啡和可待因），但不检测芬太尼和美沙酮等合成类阿片[6]。使用色谱技术的优点是可以在一种方法中识别所有不同的阿片类物质，以针对不同类别。它还提供了样品中每种阿片类物质的定量结果，而不是定性免疫分析结果。

测定尿液中阿片类药物的其他技术包括色谱“稀释并射出”法[7,8]，这涉及用内标溶液稀释样品并直接注入LC-MS系统。然而，与固相萃取（SPE）方法相比，它不允许样品浓缩。由于尿样中通常存在低水平的阿片类物质，这可能会导致假阴性，尤其是在质谱仪上没有强烈响应的阿片。SPE还可以从尿液样本中去除稀释射样法中存在的任何基质成分。这些可能会影响类阿片的电离作用，并在MS源中累积，导致结果不可靠。这就延长了测试的前置时间，增加了昂贵的重新测试和仪器维护时间。

本申请说明说明了SCX混合模式SPE方法与UHPLC-MS/MS相结合，如何以可靠和可重复的方式分析人体尿液样本中的12种天然、半合成和合成阿片类药物和代谢物。

化合物：

吗啡、氧吗啡酮、去甲氧基考酮、氢可酮、去甲基考酮、O-去甲基-双-曲马多、去甲芬太尼、双-曲马多、哌啶、芬太尼，EDDP，美沙酮。所有化合物均以1 mg/mL的格式从Cerilliant购买。

样品制备：

在甲醇中制备所有类阿片原料（3µg/mL）。为了制备尿液样品，将12.5 mL混合来源的混合性别空白人尿液与625µL阿片储备溶液混合。空白样品的制备方法是将12.5 mL尿液与625µL甲醇混合。样品和空白样品均用1%甲酸在水中以1:1的比例稀释，并旋转一分钟以使溶液均匀。

对于混合模式SPE，Microlute的每个阱™ CP SCX 30 mg 96孔板

（分类号PSCX030P-001）用1000µL甲醇进行调节，然后用1000μL水进行平衡。将每个预处理样品和空白样品全部装入平板。装载后，使用1000µL 0.1%甲酸溶液清洗每口井，然后使用1000μL 0.1%甲醇甲酸溶液。用2 x 400µL 45:45:10甲醇/乙腈/TEA洗脱每个孔。使用MiniVap®Gemini（产品目录号500234），使用96针头和直针（产品目录编号229036）在室温下在N2下蒸发洗脱液至干燥，大约需要45分钟。在100µL起始流动相（水中0.1%甲酸）中重新配制样品。通过用100µL阿片类标准溶液（1500 ng/mL）在起始流动相（0.1%甲酸溶于水）中稀释，重新配制空白溶液孔，制备峰后标准。同样的程序也在市售的松散填充96孔板上进行（图1）。

结果和讨论

色谱法

图2显示了150 ng/mL校准标准中所有化合物的色谱图。色谱图的峰分配见表1。

LC方法从100%水溶液开始，以确保在从色谱柱中洗脱任何阿片类物质之前，在运行开始时洗脱注射溶液中可能存在的盐和最极性成分。这可以防止这些化合物干扰阿片类化合物的电离。

第一个洗脱的阿片类药物峰是吗啡，洗脱时间为3.60分钟，最后一个洗脱峰是美沙酮，洗脱时限为7.71分钟。除氢可酮及其代谢物去甲氢可酮（化合物4、5）外，所有峰均被分解。由于前体离子不同，这意味着信号不受干扰。

表1列出了12种经分析的类阿片和代谢物。各种化合物都有不同的极性，去甲氧基考酮的LogP值为0.70时最亲水，EDDP的LogP为5.20时最疏水。所分析的所有化合物均为弱碱，pKas范围为8.2-10.1，这意味着SCX（强阳离子交换）树脂是最适合捕获和产生清洁样品并注入LC-MS系统的SPE树脂。

回收率和再现性

此应用程序使用100µL的复原体积，使装在平板上的原始1 mL尿液浓度达到10倍。这使得所分析的每种化合物具有更高的灵敏度。SPE的过程有助于通过将分析物结合到树脂上，同时冲洗掉尿液基质中存在的干扰化合物，从而形成一种更清洁的溶液——高水洗可清除任何极性化合物，甲醇洗可洗脱疏水性酸性和中性干扰。当样品从SPE产品中洗脱时，这两种清洗有助于形成非常干净的溶液，因为在执行洗脱步骤时，应仍然存在最小的干扰。

在使用微量滴定液进行样品制备后，测量添加到人类尿液中的12种化合物的回收率™ CP SCX 96孔板。图3。显示了12个重复样品中所有化合物的平均回收率，即尿液样品加标前样品制备。除哌替啶和EDDP外，类阿片的回收率均大于80%。

使用与微量稀释液相同的方法，将回收率与市售30 mg散装产品进行比较™ 用于比较的CP SCX板。两种产品的比较如图4所示。与杂化聚合物相比，松散填充产物的回收率显示出每个分析物的回收率降低。这种减少被认为是由于混合聚合物的结构导致的，这种结构在分析物和色谱介质之间提供了更有效的相互作用。因此，分析物和溶剂在微液中的通道效应总体上减少了™ CP SCX板。

流道化是液体通过SPE床以最小阻力的路径流动的过程。因此，当尿液被加载到平板上时，由于SPE床的流动路径不均匀，它可能无法与所有存在的树脂充分相互作用。这有效地降低了产品的负载能力，并可能导致分析物突破，导致低回收率。第二个问题是，在洗脱过程中，溶剂与结合分析物接触较少，这可能导致回收率较低，与混合聚合物的洗脱体积相比，需要更大的洗脱容量。

Well-to-well reproducibility is a measure of how close each recovery result is to each other between different wells of the 96 well plate. It is an important measure to allow confidence in results collected. When a low reproducibility is recorded it can bring doubt into the results collected. For method validation, it is an important metric to look at with suggested guidelines in place for what level is acceptable. Chromatographic bioanalytical assays typically have a guideline of <15 % RSD or <20% if at the LOD or LOQ level [12, 13, 14] to validate a method. This is a very important measure for a test in which you need confidence in like an opioid test which can have large consequences for the patient who has been tested.

图5显示了回收结果的%RSD。数据显示，%RSD值从吗啡的1.39%到EDDP的5.95%不等。这些数字表明，这12个重复的再现性在通常用于方法验证的%RSD指南的典型建议限值内。

总结

Microlute™ CP SCX is able to detect a wide range of opioids in urine including natural, semi-synthetic and synthetic compounds making it the obvious choice for drugs of abuse analysis. The process of SPE allows for concentration of samples to allow for more sensitive analysis of lower concentration samples. This is not possible for ‘dilute and shoot’ methods due to the core principle of that method is to dilute down the sample. The Microlute™ CP SCX “microplate also offers advantageous recoveries across the range of different classes of opioids with high reproducibility <10 % RSD values. This ensures the product gives reliable and reproducible results which is an important metric in drugs testing where confidence in the data output is required.