HPLC方法开发中质谱和紫外数据的整合用于峰跟踪

高效液相色谱（HPLC）是支持药物开发的最广泛使用的分析技术。仪器设计、色谱柱技术（UHPLC）、软件和自动化的进步导致了方法开发周期的缩短，以及技术的“绿色化”，同时减少了溶剂的使用和浪费。这些进步，以及从多个探测器连接和获取数据的能力，很可能在可预见的未来保持其作为领先分析平台的地位。

在药物方法开发中引入设计质量（QbD）和生命周期管理概念有望在方法生命周期中提高方法的质量。稳健分析方法设计空间（QbD方法的核心要素）的定量表征一直被证明可以提高方法性能和重复性，从而减少下游故障[1、2、3]。这种分析方法设计空间最近在分析QbD圈中被称为方法可操作设计区域（MODR）[4]。Fusion QbD（S-Matrix Corporation，Eureka，CA USA）等软件促进了这种方法，能够生成统计上可辩护的多因素设计实验，自动将这些实验转录为色谱数据软件（CDS）中的现成序列和仪器控制方法，并直接从CDS导入所有实验结果，以实现自动建模和可视化。

为了充分实现QbD分析的好处，支持技术还必须能够解决复杂样品中所有潜在杂质和降解产物的分离问题。样品中含有缺乏发色团的分子，或者紫外吸收度随pH值变化的分子，这使方法开发变得复杂。因此，利用质谱检测来识别和跟踪这些有问题的样品化合物将大大提高方法开发的效率，从而提高最终方法的性能和信心。尽管有许多MS仪器可用于协助鉴定产品和杂质，但色谱师一直希望将MS的验证能力与常见的色谱数据系统和方法开发中通常使用的UV检测相结合。最近，Acquity QDa（一种小型质谱检测器）与Waters Corporation（马萨诸塞州米尔福德）的Empower色谱数据软件（CDS）结合使用，使得将MS数据集成到方法开发中既简单又经济。

为了支持QbD方法的开发，进行了筛选和优化实验，主要关注最可能影响分离的因素，例如色谱柱化学、溶剂组成、pH值、色谱柱温度和反相色谱梯度斜率等因素。统计设计的实验相对于蛮力-一切可能的组合方法，为多因素实验区提供了极为有效的采样，并且比增量试验-错误方法提供了更多基于知识的数据。设计的实验还有一个额外的好处，即用户可以结合研究重要参数，从而可以表征和可视化它们对方法性能的交互影响。

从方法开发实验结果中获得的最有价值和最有用的知识是，当因子水平设置组合在整个实验区域内变化时，组合因子对每个样品分子的保留和峰形状的确切影响。提取这一知识通常需要能够明确地定位和跟踪实验数据集中每个样本峰的形状和保留率变化，也就是峰值跟踪。跟踪每个实验色谱图中的每个峰通常是一项手动且具有挑战性的工作，即使使用色谱数据软件中的便利工具也是如此。当两个或多个峰同时洗脱或改变实验运行之间的洗脱顺序时，峰跟踪变得更加复杂。

众所周知，使用光电二极管阵列（PDA）光谱数据进行峰值跟踪的局限性[5]。在没有验证性质量数据的情况下，手动跟踪峰值需要进行加标实验，或仔细控制样品混合物，以便通过面积或峰高响应观察简单迁移或共洗脱的测定。利用来自集成质谱仪的质量数据极大地促进了峰的识别，但迄今为止，还需要对增加的数据量进行额外的手动操作。

为了缓解这个问题，S-Matrix开发了PeakTracker™ – 一种强大的新型UV/MS峰值跟踪技术，用于自动化、优化和简化PDA和MS数据在LC和LC/MS方法开发中的使用。PeakTracker完全集成到用于LC和LC/MS方法开发的S-Matrix的Fusion QbD软件中，使用3D PDA光谱数据以及标准UV峰结果数据，自动识别每个实验色谱图中的每个峰。PeakTracker还自动利用3D质谱数据在配置了Waters Acquity QDa质量检测器（QDa）的LC系统上进行实验。PeakTracker可以自动解决复杂的分离和跟踪挑战，包括：

•部分和完全共洗脱峰的自动反褶积。

当两个峰共洗脱时，共洗脱峰对中的一个峰将“隐藏”在UV色谱图中。对于峰共洗脱的所有实验运行，该峰的标准UV结果数据（如保留时间和分辨率）将丢失。这对从方法开发实验结果导出的预测模型产生了负面影响。使用PDA和MS光谱数据自动定位“隐藏”峰并填充缺失结果数据可以显著提高预测模型的质量。

•具有相同质量数据的两个或多个峰值。

在许多情况下，两个峰值具有相同的母质量值，因此具有相同的质量荷电比（m/z）。在这些情况下的解决方案是使用质谱仪，该质谱仪能够分离所有可电离化合物，并结合光谱库进行识别。然而，在许多负责开发LC方法的实验室中，这种能力是不可用的。利用经济的质量检测器，并将其与利用紫外光谱数据和标准峰值结果数据的自动诊断相结合，为这个问题提供了独特的解决方案。

•非吸收和非电离化合物。

在大多数情况下，最好使用与质谱仪兼容的液相色谱法来解析所有样品化合物。当样品含有如图1所示不吸收（无UV数据）或如图2所示不电离（无MS数据）的化合物时，这一目标变得复杂。这些情况需要将PDA和MS光谱数据耦合到自动峰值跟踪协议中。这样可以创建一个合并色谱图，其中包含数据建模所需的所有峰和相关结果数据。

PeakTracker还集成了完成跟踪工作流所需的其他特性和功能。这包括（1）如图1和图2所示，对每个峰的MS和PDA光谱数据进行成对的图形和数字显示，以及用于手动操作跟踪结果的便利工具，（2）每个实验运行的UV色谱图和总离子色谱图（TIC）的堆叠显示，用于简单的视觉比较和跟踪确认。此外，如图3所示，PeakTracker显示了一个用户可过滤的UV峰结果表，其中带有高亮颜色，以便于识别峰数据的跟踪更新，例如，更新共洗脱峰的缺失数据，以及添加合并到UV色谱图中的非吸收峰的数据。跟踪完成后，PeakTracker会自动将化合物名称映射到CDS为实验色谱图中所有识别峰计算的所有UV结果数据，以进行自动建模和可视化。自动峰跟踪在色谱数据框架内充分利用PDA和MS数据，大大简化了MS数据到方法开发工作流的集成。此外，将非吸收峰纳入UV实验色谱图的能力直接支持了MS兼容HPLC方法的开发，这对生产和质量控制都非常有益。