用质谱法加速ADC的发展

抗体药物结合物（ADC）虽然为靶向治疗提供了令人兴奋的新机会，但它是一种复杂的分子，具有重大的分析挑战。ADC的药物抗体比（DAR）和药物分布曲线（DDP）是很难单独使用液相色谱法确认的关键质量属性。幸运的是，更新、先进、高通量的质谱法能够快速、灵敏、准确地测定各种类型ADC的DAR、DDP和其他重要产品质量属性。

介绍

保罗·埃利希（Paul Ehrlich）于1913年首次提出了通过与“触觉载体”的连接将细胞毒性化合物特异性地传递给癌细胞的概念[1]。2013年，美国食品和药物管理局（FDA）批准了第一种抗体药物结合物（ADC）。到2020年初，市场上已有8家FDA批准的ADC[2]。这些靶向治疗很有吸引力，因为通过抗体与特定抗原（通常位于癌细胞表面，但在某些情况下位于其他细胞或自由浮动蛋白质上）的结合，它们能够将小分子细胞毒药物控制地传递到所需的作用部位，减少与全身给药相关的副作用，提高疗效并可能减少所需剂量。

ADC由大生物分子（抗体）、某种形式的连接剂和化学治疗剂组成。连接器的设计目的是在ADC在体内循环时保持结合，并且只在作用靶点释放细胞毒性有效载荷。利用了各种共轭方法、连接器和有效载荷，第二代和第三代ADC具有改进的体内性能。共轭通常使用天然或工程表面赖氨酸或半胱氨酸残基实现。

与半胱氨酸残基形成硫醇键相比，与赖氨酸残基形成键具有更少的异质性。位点特异性方法可以精确控制平均药物抗体比（DAR）和结合位点的数量。也使用酶介导的方法。因此，ADC的异质性水平在很大程度上取决于所采用的共轭技术。在最坏的情况下，抗体支架的60个潜在结合位点上的最大药物有效载荷为8，可获得109种以上的独特结合物种。

在所有情况下，产生的ADC药物产品都是高度复杂的异质分子，可能含有许多与产品相关的物种，这些物种可能会影响这些重要治疗的质量、疗效和安全性。鉴于这种高度复杂性，ADC的完整特征不仅对质量评估至关重要，而且对过程优化也至关重要。

DAR和DDP的测定以及共轭位点的识别至关重要。此外，正确估计共轭效率可以优化共轭化学，从而提高ADC的均一性和产品质量。

DAR和DDP测定的广泛使用方法包括疏水作用色谱法（HIC）和还原法，然后是反相高效液相色谱法（RP-HPLC）和紫外检测法。前者可以揭示共轭程度，通常能够充分解析和表征每个DAR物种，而后者则涉及根据重链和轻链在有共轭有效载荷和无共轭有效载荷情况下的不同保留时间对其进行评估。然而，这两种方法都很耗时。

因此，需要快速而敏感的特定分析技术来加速ADC的发展。液相色谱法与高分辨率质谱法相结合，可以使用完整和/或亚单位分析计算产品开发期间ADC的DAR。自下而上的方法，包括在MS分析之前将蛋白质酶消化成肽，有助于确定准确的结合位点，但对整体DAR测定效果较差。

液相色谱-质谱（LC-MS）方法利用亚单位水平和完整方法，结合先进的仪器平台和软件系统，可以作为快速分析ADC的稳健方法，提供所需的速度、样品容量和精度组合，同时提供有价值的、可重复的、，信息丰富的数据。这些方法越来越受到人们的关注，因为当共轭物被广泛应用时，疏水性较小的细胞毒性有效载荷具有良好的效力和更大的单体稳定性。

虽然LC-MS可能并不普遍适用于所有ADC，但它确实代表了ADC表征的基本、主要分析平台。分析方法的具体选择必须考虑到共轭方法和细胞毒性有效载荷的特性。以下是基于MS-的方法应用于加速ADC开发的几个示例：

•尺寸排除色谱法，带有连续紫外检测和质谱检测（SEC-UV-MS）多属性方法（MAM），使用完整和中上分析方法实现高通量工作流

•半胱氨酸和赖氨酸侧链共轭ADC的LC-MS表征

•LC-MS监测半胱氨酸连接ADC中马来酰亚胺开环，以优化共轭过程

•通过亚单位和肽映射分析表征位点特异性ADC

•完整半胱氨酸连接ADC的本地LC-MS分析

•基于纳米体的ADC的LC-MS分析

实验

在所有研究中，Exion LC系统与配备Turbo V离子源的SCIEX X500B QTOF系统或配备IonDrive Turbo V离子来源的SCIEX TripleTOF 6600系统一起使用。

•对于半胱氨酸和赖氨酸侧链共轭的ADC的LC-MS表征和马来酰亚胺开环的监测，采用Phenomenex bioZen完整XB-C8，3.6微米，100 mm柱，也结合SCIEX X500B QTOF系统[3]。

•为了表征位点特异性ADC，使用bioZEN 3.6μm完整C4柱进行亚单位分析，使用Aeris 1.7μm肽XB-C18柱进行肽图绘制。在这两种情况下，均使用SCIEX TripleTOF进行MS ®6600系统[4]

•对于完整半胱氨酸连接ADC的本地LC-MS分析，SEC之后是SCIEX TripleTOF 6600系统上的MS[5]。

•对于基于纳米体的ADC的LC-MS分析，使用Phenomenex bioZen完整XB-C8，3.6微米，100 mm柱进行完整蛋白质分析，使用bioZen-肽XB-C18，2.6微米，150 mm柱进行肽分离。两者均耦合至SCIEX X500B QTOF系统[6]。

用于数据处理、解释和量化的软件包括SCIEX OS软件、BPV Flex软件和BioPharmaView软件。有关准确实验条件的更多详细信息，请参阅为每项研究提供的参考资料。

结果和讨论

半胱氨酸和赖氨酸连接ADCs的LC-MS分析[3]

使用中上LCMS对硫醇共轭ADC物种进行表征

工作流。将样品脱糖，并将其进行化脓链球菌（IdeS）免疫球蛋白G降解酶消化，然后用三羧乙基膦（TCEP）还原，以裂解任何剩余的二硫键，从而提供具有类似分子量的Fc/2、Fd和轻链亚基。在电离之前执行快速脱盐色谱步骤，总样品运行时间仅为6分钟。

分析了由曲妥珠单抗结合到代表性有效载荷α-阿曼丁和auristatins mc-MMAF和vc-MMAE的ADC，以证明该方法的有效性。观察到轻链亚单位只有一个毒素连接，而Fd亚单位有一个、两个或三个总药物结合。与用HIC-UV进行DAR分析不同，此LC-MS方法产生了高度分析物特定的质量信息，该信息不受共轭引起的任何改变的UV特征的影响。

然而，将这种方法用于更疏水的毒素可能具有挑战性，因为这些有效载荷会影响ADC的电离特性。通过改变电离条件，可以分析与多卡霉素结合的曲妥珠单抗。当曲妥珠单抗与吡咯苯并二氮杂卓（PBD）SG3249偶联时，由于其易于形成加合物，这种方法并不成功。因此，如果时间至关重要，HIC可能更适合这种类型的ADC；然而，考虑到可以获得更详细的信息，投资于LC-MS方法的开发将是非常有益的。

通过赖氨酸残基的结合通常会产生更多的异质DAR分布，由于糖类成分的异质性，因此具有更大的质谱复杂性。在样品制备过程中添加脱糖步骤可以降低所得光谱的复杂性。该LC-MS方法用于西妥昔单抗的赖氨酸共轭物，该共轭物的有效载荷在4到13之间，平均DAR为9。

半胱氨酸连接ADCs中马来酰亚胺开环的LC-MS监测[3]

DAR分析的LC-MS应用范围超出ADC产品的质量评估。它还可以用于流程和产品开发。

例如，在半胱氨酸连接的ADC中，该键通常通过亲核加成形成马来酰亚胺-半胱氨酸键。在某些情况下，这种连接反应可能是可逆的，或者可能存在另一种亲核试剂，这将导致逆迈克尔加成反应的发生。这种不良反应可能导致体内稳定性较差，并可能降低安全性和有效性。

在马来酰亚胺部分旁边添加某些官能团可以通过防止这些不必要的反应来提高马来酰胺类半胱氨酸连接物的稳定性。这种方法需要具有高分析特异性的监测，LC-MS对于跟踪马来酰亚胺-半胱氨酸连接形成过程中发生的开环过程非常有用。

为了证明这一技术，通过HIC-UV和LC-MS分析了包含与三种不同的基于马来酰亚胺的MMAE连接体偶联的曲妥珠单抗的ADC。用前一种方法无法通过质量确认特定ADC的形成。用后一种方法，结合质量分析和色谱保留时间，可以区分三种ADC。LC-MS也被发现适用于监测不同反应条件（pH、温度等）下随时间变化的开环程度。将LC-MS集成到实验策略设计中，可以优化共轭过程。

通过亚基和肽映射分析表征位点特异性ADCs[4]

MS仪器和软件的进步提高了MS用于ADC分析的适用性。

为了证明SCIEX TripleTOF 6600系统及其IonDrive Turbo V离子源和BPV Flex软件2.1的有效性，该软件包括完整和肽映射工作流以及共轭肽的自动DAR测定、序列确认和相对定量，评估了在不同共轭条件下制备的三个ADC样品，其中包括与Gly-Gly-Gly Val-Cit对氨基苄基氧羰基（PAB）单甲基auristatin E（MMAE）偶联的曲妥珠单抗（Gly-Gly-Val-Cit-PAB-MMAE）。使用转谷氨酰胺酶（TG）将有效载荷结合到曲妥珠单抗轻链（LC）上的一个高度特异的结合位点。

对于亚单位分析，ADC与TCEP孵育。LC和重链（HC）的原始数据光谱被重建为“零电荷状态”，允许分配HC的主要糖基化形式和LC的无药和药物结合形式。肽图谱样品经过还原、烷基化和消化。两种方法的DAR计算结果是一致的，表明亚基分析为快速、简单和高度重复的ADC表征提供了一种可靠的肽映射替代方案

此外，在所有ADC样品中，无药物肽主要以脱酰胺形式存在，这是谷氨酰胺转胺酶在低pH水存在下催化谷氨酰胺残基脱酰胺的结果。对于在无药物的情况下用TG与曲妥珠单抗孵育后产生的ADC，脱氨作用明显。毫不奇怪，与TG和药物预孵育导致较少的脱酰胺，而没有预孵培养导致有限的脱酰胺发生。共轭效率与脱酰胺水平呈负相关。

完整半胱氨酸连接ADCs的本地LC-MS分析[5]

虽然如前几节所述，亚单位分析可以提供非常有用的信息，但本地LC-MS分析提供了一种非变性方法来分析完整的ADC，而无需消化和还原。这种分析可以通过使用挥发性水缓冲液将SEC与MS分析耦合来实现。在这些原生条件下，ADC保持其三维结构，从而在原生分析期间占用更少的电荷，从而导致信号分布更少，样品不同特征在m/z轴上的间距增加。由于样品处理而引入人工制品的可能性也较小。

为了演示本机ADC分析的威力，半胱氨酸连接的ADC样品（针对鸡蛋溶菌酶的小鼠单克隆抗体与PAB MMAE偶联。使用装有IonDrive Turbo V源的TripleTOF 6600系统，该系统提供了保持分子完整所需的软条件，非共价样品被有效电离、去溶剂化，并在其完整状态下进行检测。高质量的原始光谱为使用BioPharmaView软件重建为“零电荷状态”，允许分配主要蛋白质组。

检测到该蛋白时没有任何药物负荷（裸单克隆抗体），使用了两种药物和四种药物。对于每种药物负荷，如预期的那样观察到不同的糖类。主要蛋白质组被自动分配，并用于计算2.78的DAR值。重建数据中发现的其他峰与MC-vc-PAB-MMAE负荷的部分损失和糖基化的损失有关。

总的来说，使用BioPharmaView软件处理本地ADC的原始数据，使用户能够用最少的实际操作时间访问关键质量属性，如DAR。高质量的原始数据还提供了关于不太丰富的蛋白质特征的额外信息，从而进一步深入了解ADC样品的复杂分子细节。因此，本机SEC-MS通过快速向其他分析工具提供正交信息，支持全面的ADC分析。

基于纳米体的ADCs的LC-MS分析[6]

除抗体外，其他抗体相关产品也可用于开发靶向结合疗法。纳米体是从骆驼体内常见的仅含重链抗体衍生而来的单域抗体，其大小仅为典型IgG抗体的一小部分，因其具有更高的热稳定性和化学稳定性以及更好的组织渗透性而备受关注，缺乏糖基化，易于在原核细胞中制造。

因此，需要对这些新实体的完整性、结构和修改进行特征描述，以帮助产品开发并确保最终产品质量，LC-MS提供了一种信息丰富的方法。完整的蛋白质分析可以快速、合理地确认分子量，并对潜在的副产物进行初步评估，共轭物可以轻松、可靠地量化。此外，肽映射可以精确定位和相对量化即使是非常低丰度的修饰，以及确认正确的二硫键形成。

通过评估通过蛋白质N末端或赖氨酸侧链上的游离胺或通过游离半胱氨酸的硫醇基团与生物素或染料Alexa Fluor 488（AF-488）偶联的四种不同纳米体，证明了这些能力。

对于完整分析，每个纳米体及其标记形式的TOF-MS数据是使用通用LC-MS方法通过同位素分辨率获得的。重建每个纳米体样品（裸样品和共轭样品）的数据，以便以非常高的精度确认预期质量。该方法还用于监测不同的共轭条件及其对其中一个纳米体的平均生物素负荷的影响，从而实现从小于1到接近2的优化。

在非还原条件下使用通用LC-MS/MS工作流程消化纳米体结合物后，进行肽图绘制。高达100%的优良序列覆盖率，由高质量的MS/MS数据支持，可用于序列确认和所有标记位点的识别。对于生物素结合物，测定了N末端肽和赖氨酸残基的生物素标记百分比，并显示生物素在多个位点上以可变效率结合。该信息对于验证标签指向对纳米体抗原结合干扰最小的位置至关重要，并有助于改进标签方法，以实现最佳纳米体结合功能。AF-488结合集中在两个工程半胱氨酸残基上。

结论

本文给出的示例强调了LC-MS方法在快速表征ADC方面的用途，以及MS作为正交方法在工艺/产品开发和产品质量测定中的价值。完整方法和亚单位方法都可以用于评估多种类型的ADC，包括纳米体共轭物。具体的选择方法取决于ADC的性质，尤其是有效载荷。在大多数情况下，样品制备和分析时间都很短，但获得的信息比利用UV检测的更传统的色谱方法通常可以获得的信息更多。因此，LC-MS应被视为加速ADC开发的重要工具。