摘要

在过去几年中,µ柱阵列色谱柱对低流量LC/MS应用产生了影响。在这里,我们将讨论这种生产色谱柱的创新方法,以及它可以为分离性能、再现性和稳健性提供的改进。


介绍

在过去的几十年里,液相色谱(LC)已经成为生命科学研究、产品开发和质量控制中最常用的分离技术之一。液相色谱系统的核心是分离柱,样品化合物在这里相互分离,以便于最佳检测和定量。

液相色谱柱技术最显著的发展之一是不断减小粒径。许多研究人员都会记得Waters推出了UPLC®或Ultra Performance Liquid Chromatography和1.7μm全多孔二氧化硅颗粒色谱柱[1],随后迅速推出了其他制造商,包括安捷伦、Phenomenex和Thermo Scientific,他们拥有自己的亚2µm颗粒UHPLC(Ultra High Performance液相色谱)色谱柱。结合不断改进的颗粒形状和纯度,较小的尺寸可以在分辨率、速度和灵敏度方面实现更高效的分离。然而,粒径较小的色谱柱产生较高的背压[2],需要较高的泵压能力。传统HPLC泵的工作压力通常高达6000 psi或420 bar,非常适合运行3-5µm颗粒柱。UHPLC泵在显著增加的压力下运行,当前压力高达22000 psi或1500 bar[3]。进一步的UHPLC系统优化,例如减少从溶剂混合器到色谱柱顶部的梯度延迟体积,以及从色谱柱到检测器的柱外体积,使亚2µm颗粒色谱柱能够证明其最佳性能。

另一种发展产生了实心颗粒,也称为熔核或表面多孔颗粒。这些颗粒的直径通常在2-3µm之间,其无孔核心覆盖着一层薄多孔层,从而提高了分离效率和分析速度,而无需像亚2µm颗粒那样高的背压[4]。为了充分利用熔融核心颗粒柱,传统的HPLC系统可能需要优化流体流动路径和体积,但所需的泵压通常是可用的。


µ柱阵列色谱柱的研制

在过去三十年里,一种制造分离柱的新方法浮出水面。受Fred Regnier小组在20世纪90年代提出的最初建议[5,6]的启发,开始研究开发微机械柱阵列柱。μ-柱可以在分离通道内以完美的顺序放置,并充当分离主干。柱-柱重复性的潜力明显高于随机填充柱,这与分离效率的可能改进一样,与传统填充床柱相比,其因数为2-3[7]。

此外,μ柱结构可降低流动阻力。与亚2μm颗粒柱相比,柱直径和柱与柱之间的距离都可以严格控制,不仅可以实现均匀的分离路径,还可以创造出能够在大大降低的背压下运行的结构[8]。这为更长的立柱提供了机会,示例高达4 x 200 cm,耦合在一起,在其最大压力350 bar以下运行[9]。


µ柱阵列色谱柱的技术背景

与用于填充传统色谱柱中具有固有尺寸分布的颗粒的相当随机的浆料填充过程相比,该过程导致颗粒在流动路径中的某种随机分布,因此设计了微柱阵列色谱柱中固定相的主干,与微芯片中的电子电路设计方式大致相同。这种设计以光刻掩模的形式被用来利用光在硅片上一次又一次地再现相同的几何图案,这一过程称为光刻。简而言之,首先用光刻胶覆盖覆盖有适当硬掩模材料层的硅片[10]。通过光掩模的照射光将几何图案投影到感光材料上,从而在抗蚀剂材料化学显影后复制图案。随后,干法蚀刻步骤将移除未受剩余光刻胶保护的区域中的硬掩模,使这些区域可用于深度反应离子蚀刻(DRIE)。此DRIE步骤以循环方式去除未保护区域中的硅,留下光掩模定义的完美垂直柱和通道壁。在这样做的过程中,形成的分离通道始终包含相同数量的柱,始终位于相同的定义明确且完全有序的位置,从而产生相同掩模的几乎相同副本(位置和尺寸的典型变化均为±50 nm)[11]。

为了获得更高的负载能力,随后使用硅片作为阳极的电化学阳极化工艺,将得到的微结构晶圆表面呈现为多孔。尽管约5µm的最小板高度几乎没有增加,但C项随着多孔层厚度的增加而显著增加[12]。考虑到这一点,与无孔情况相比,标称厚度为300 nm的多孔层增加了30倍的负载能力,同时将C项保持在可接受的水平[13]。经过几个后处理步骤,将结构化硅片阳极连接到玻璃片上,以获得封闭的流体结构。最后一步,单个柱状芯片通过一种称为切割的过程从晶圆玻璃堆中分离出来[14]。

通过首先使用UV固化粘合步骤将入口和出口毛细管插入并固定在相应通道中,然后使用提供保护外壳和适当HPLC配件的组装步骤,将单个µ-芯片转换为色谱柱。最后一步,通过将裸主干连接到PharmaFluidics专有的专用湿表面化学站,将粘结相应用于支柱和通道壁的自由表面。

µ-柱阵列柱技术的强大之处在于,设计和实现可以根据柱形状和直径、柱位置和柱间距以及蚀刻深度调整到特定的工作流程。


应用领域

在当今的实验室中,μ柱阵列色谱柱已被广泛应用于组学和相关研究。μ柱阵列色谱柱的流动状态可分为两个不同的范围,纳米液相色谱在50-2000 nL/min和毛细管液相色谱(在1-15μL/min)。µ柱阵列色谱柱的延伸长度高达200 cm,符合要求最高灵敏度、分辨率和再现性的组学应用的要求,并且在只有最小样品体积的情况下非常理想[15,16]。

纳米液相色谱(NanoLC)是蛋白质组学中的金标准分离技术之一,可以与质谱(MS)无缝连接。尽管在质谱检测和纳米液相色谱系统方面取得了技术进步,但纳米液相色谱仪色谱柱的进一步发展却略显不足。与nanoLC系统的连接已明显改善,以Thermo Scientific nanoViper连接为主要示例。还尝试降低从色谱柱到发射器的体积,例如PicoFrit®(新目标)和EASY-Spray™ (Thermo Scientific),以及基于芯片的分离,如ionKey(Waters)。但是,传统的填料床分离通道仍然保持在所有这些格式中,存在上述可能的局限性。

在这里,μ柱阵列色谱柱可以向前迈出重要一步,进一步优化低流量LC/MS的性能。充分利用前面描述的微机械光刻制造工艺以及对μ柱尺寸和位置的严格控制,可以实现最高的柱到柱再现性。图2显示了从相同的细胞色素c消化液中分离出来的七个μ柱阵列柱的再现性,九个的平均变异系数为0.63%。

此外,μ柱是蚀刻分离通道的原始晶圆的一部分。如表1所示,结合大大降低的背压,这使得纳米柱上的样品注入数量远高于通常预期的数量。图3显示了μ柱阵列色谱柱的寿命实验,该实验运行了六个月,分离了1000个HeLa消化物,每个消化物随后进行空白和细胞色素c消化物注射,结果在单个μ柱阵列柱上总共进行了3526次注射。HeLa消化物分离以30分钟的梯度、60分钟的循环时间进行,流速为1μL/min。流动相A和B在实验开始时制备,在实验期间不刷新。尽管流动相发生了降解,但HeLa消化物分离的可重复性非常出色[17]。

此外,随着蛋白质药物的重要性日益增加,蛋白质组学工作流程正在进入制药和生物技术实验室,肽图绘制成为发现和开发治疗性单克隆抗体(mAb)或抗体药物结合物(ADC)靶点的重要部分。这些分子较大(约150kDa)且不均一,在翻译后修饰、氨基酸结构和高阶结构方面存在差异[18]。随着大量原始单抗药物的专利到期,生物仿制药有望问世。顾名思义,它们必须高度相似,但不完全相同。为了表征和监测这种相似性,需要高灵敏度和高分辨率的LC/MS。图4显示了使用胰蛋白酶消化肽图对原始Remicade药物与候选生物仿制药进行比较的示例,并清楚地显示了总化合物色谱图中的五个不同之处。

但是μ柱阵列柱不仅限于肽映射应用。代谢组学和脂质组学的研究人员也在进行更多的样本限制实验。尽管纳米LC/MS可能并不总是他们的首选,尽管可以实现灵敏度,但正在研究减少的柱ID。在低微升/分钟流速下取得了令人满意的结果,通常使用300µm ID色谱柱[19]。然而,这些色谱柱将使用与其纳米LC对应物相同的固定相进行填充,所面临的挑战与上述相同。

同样,这里也可以使用µ-柱阵列柱。例如,脂质组学的样品复杂性相当大,LIPID MAPS结构数据库由将近45000个独特的脂质结构组成。μ柱阵列色谱柱长度为200 cm,这些色谱柱非常适合承担这种复杂性,如图5所示,其中以60分钟的梯度分析了人血浆脂质提取物[20]。上面的痕量显示了LC-MS复合色谱图,这不仅表明了样品的复杂性,还表明了μ柱阵列色谱柱获得的高分离效率。在色谱图中可以很好地区分主要的脂质类别。


结论

μ-柱阵列柱可以在LC/MS应用中提供巨大的进步。这种结构的新方法使得分离通道的设计更加灵活,有望实现色谱方法的放大或缩小。通过μ柱的完美有序定位和对尺寸的严格控制,可以在柱内实现更均匀的流动路径,最大限度地减小峰展宽效应并提高注射到注射的再现性。如HeLa消化实验所示,即使柱长为200 cm,随着背压的降低,柱的稳健性也可以显著提高,从而允许更多的样品注入。

随着用于增加流速范围的产品的开发,μ柱阵列柱将继续用于更多的液相色谱应用。目前,它们的可用流速高达15μL/min,这对使用有限样品量的研究人员来说是一个诱人的流速。但μ柱的前景可能也会扩大到更高的流速。


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