使用带荷电气溶胶检测的UHPLC识别和定量紫杉醇及其降解物和其他相关杂质

癌症是世界范围内导致死亡的主要原因之一[1]，这促使人们对开发创新药物治疗以改善患者护理产生了广泛兴趣。其中一种药物紫杉醇用于不同类型癌症的化疗[2]。为了开发一种像紫杉醇这样直接注射到静脉中的药物，需要进行严格的药物测试，以确保杂质和相关物质不会被纳入最终药物配方中。然而，由于缺乏检测或响应变化，在稳定性和降解研究中，UHPLC等常规监测方法可能会导致产品定量的不确定性[3]。使用UHPLC-UV-CAD等组合方法可以更好地满足ICH关于化合物报告、鉴定和鉴定的指南[4]。

介绍

鉴于全世界近六分之一的死亡是由癌症引起的，预计到2030年，每年将有2360万新的癌症病例[1,5]，寻找比当前治疗更有效的新疗法是许多制药公司和癌症研究人员的首要任务。治疗类型众多，可能因癌症类型和进展而异，包括化疗、放疗、免疫治疗、激素治疗和靶向治疗。例如，化疗药物紫杉醇是广泛癌症的标准治疗方法。尽管它是在20世纪60年代从太平洋红豆杉树皮中分离出来时发现的，但现在它已成为一种可靠的有丝分裂抑制剂，可以减少患者的癌症负荷[2]。

在任何药物的生命周期中，监测可能使药物从安全有效转变为具有严重副作用的杂质都是极其重要的。原料药中的杂质只有在极低水平下才能耐受，因此需要使用高灵敏度的分析方法来评估药物的纯度。不仅如此，杂质也可能与活性药物成分（API）非常相似，色谱分离可能是一个挑战。无论样品的复杂性如何，ICH指南Q3A-Q3D要求准确报告、鉴定和鉴定杂质，以防止最终药物制剂出现问题[4]。

ICH杂质指南针对的是可能作为原料药降解产物、制造过程中的潜在添加物或原料药与包装材料成分之间相互作用产生的杂质[6]。这些指南是根据对任何观察到的杂质的测定进行分析而制定的，并根据最终产品中提供的活性药物成分的最大日剂量提供阈值。

在药物开发生命周期中监测杂质的标准方法包括使用超高效液相色谱法（UHPLC）和紫外/可见光检测[7]。紫外/可见光检测易于使用、灵敏，并提供相对于其目标的合理特异性。虽然这种检测方法目前是首选的原料药分析方法，但紫外响应因子可能因化合物而异，其中一些化合物甚至可能缺乏生色团，因此无法进行检测和定量[8]。由于量化方面的不确定性，这些障碍阻碍了指南的成功遵守。此外，校准标准并不总是适用于药物开发的早期阶段，但需要用于定量。通过采用一种方法，可以通过单个校准进行分析，并得出统一的响应，可以克服许多这些挑战。

作为UV/Vis的替代方法，带电气溶胶检测（CAD）可以通过产生干燥的带电气溶胶粒子来测量样品中所有非挥发性和许多半挥发性分析物的数量，这些粒子使用静电计进行检测。CAD不依赖于并非所有分子都具有的固有特性，例如紫外/可见光检测的发色团要求，而是测量气溶胶粒子的电荷，该电荷与分析物的质量浓度成正比，提供独立于化学结构的响应[9]。这一优点使CAD与复杂的药物样本兼容，即使在可变条件下也具有特定性。尽管该方法对流动相组成和梯度洗脱的变化具有敏感性，但使用补偿梯度可以克服这一问题，并确保通用和均匀的响应[10]。

在这项工作中，为了将紫杉醇从热降解实验中产生的相关化合物和杂质中分离出来，应用了UHPLC-UV/Vis和CAD。使用紫杉醇和其他两种已知相关杂质作为标准进行校准，以估计样品中其他未知杂质的数量。

实验

样品制备

本研究的校准标准包括紫杉醇及其相关杂质、杂质C和头孢曼宁[欧洲药典（法国斯特拉斯堡）和美国药典（美国密西西比州罗克维尔）]、Baccatin III[西格曼-奥尔德里奇（德国施奈尔多夫）]。称量校准标准品，并用甲醇制备至最终浓度0.1 mg/mL。将这三种物质与甲醇混合，得到10µg/mL的储备溶液。然后用甲醇稀释系列制备10、5、1和0.5µg/mL校准标准品。每个校准标准品在三个连续运行中进行分析，在不同浓度之间进行空白注射。由于标准溶液的稳定性有限，因此在分析之前直接制备。

对100µL体积的1 mg/mL紫杉醇溶液（用350µL甲醇和50µL二甲基亚砜（DMSO）稀释）进行强制降解。将溶液在65℃下培养2小时，然后立即进行分析。

仪表

热科学™ Accucore公司™ 五氟苯基（PFP）柱用于化合物分离。色谱条件如图1所示。使用Thermo Scientific进行检测™ 征服™ Flex可变波长探测器后接Thermo Scientific™ 征服™ 柔性充电气溶胶探测器。

反转渐变工作流

Thermo Scientific公司™ 征服™ 反梯度Flex-Duo UHPLC系统（图2）包括一个系统基座Vanquish Flex（P/N VF-S01-a-02）、双泵F（P/N FF-P32-a-01）、带25µL样品回路的分体式取样器FT（P/N WF-A10-a-02），柱室H（P/N VH-C10-a-02）和带电气溶胶检测器F（P/NVF-D20-a）、可变波长检测器F（N/NVF-D40-a），和反向梯度套件的Vanquish Duo（P/N 6036.2010）。

图2：Vanquish Duo逆梯度工作流的流体方案。

数据分析

Thermo Scientific公司™ 变色龙™ 色谱数据系统（CDS）7.2.8版用于数据采集和评估。

结果和讨论

具有梯度补偿的均匀响应

CAD从分析柱流动相的气动雾化开始，形成气溶胶。溶剂从较小的液滴中蒸发，形成颗粒。粒子通过与电晕放电形成的反向离子射流碰撞，在混合室内发生扩散充电。使用静电计测量气溶胶粒子的总电荷[11]。

干燥颗粒上的电荷与颗粒直径成正比，这取决于分析物的质量浓度。由于CAD是一种雾化技术，溶剂成分的变化，例如梯度洗脱方法，将影响雾化效率，从而影响检测器响应[11]。为了解决这个问题，在柱后应用逆梯度，以反映分析梯度组成；这样，在整个方法中，雾化器中的溶剂成分将保持均匀。在反梯度工作流程中，可以使用第二个泵将镜像梯度传递到分析梯度柱，使用T形件抵消有机物含量变化的影响。

使用Vanquish Duo系统对API样品进行了有梯度补偿和无梯度补偿的分析，该系统使用了Vanquist Flex双泵，如图2所示。虽然两个实验产生的峰数相同，但峰值响应存在明显差异。由于逆梯度在梯度洗脱过程中产生更均匀的分析物响应，因此它可以对复杂样品中的每个杂质进行更准确和无偏的分析[10]。

通过比较有无反向梯度补偿的CAD响应，强调了基于梯度洗脱的响应的可变性及其对溶剂组成的依赖性。在没有梯度补偿的情况下，API之前洗脱的分析物数量被低估，而API之后洗脱的研究物数量被高估，如图3所示，大约26分钟时达到峰值。如图3所示，当比较蓝色峰和红色峰时，通过在API前后的梯度上提供更均匀的分析物定量，应用梯度补偿使这种不平衡变得明显。在使用和不使用梯度补偿的组合峰面积以及由此确定的杂质含量之间观察到了超过10%的差异。使用梯度补偿的所有杂质的组合峰面积为API的53.8%，而不使用梯度补偿时，相同的峰面积是API的63.9%（图3）。这种大的变化表明了溶剂组成对CAD响应的影响，以及使用逆梯度补偿成功进行校正。

三标准线性校准

图4显示了与UV相比，使用反向粒度CAD进行准确定量的优势。由于CAD的响应取决于溶剂组成，而不取决于化学结构，因此三种标准的校准线重叠。从10µg/mL水平的标准物测量结果来看，CAD对所有三种化合物的归一化响应几乎相同，而紫外响应变化高达63%。

带有CAD检测和逆梯度的校准曲线显示了所有化合物的峰面积与分析物浓度的线性关系，说明了化合物之间的最小响应变化。这使我们有信心测量杂质水平，即使我们没有这些成分的标准。

退化分析的多检测器方法

UHPLC使用的UV/Vis和CAD各有优势，可用于未知化合物的量化，例如在药物混合物中观察到的化合物。一些化合物可能缺乏紫外吸收所必需的生色团，并且无法使用UV8进行检测，如图5中的CAD峰值在24.6和27分钟。同样，如果一种化合物太易挥发，CAD也无法对其进行雾化或检测。对紫杉醇降解产物的分析表明，感兴趣的降解产物之一只能用紫外线检测到。识别出的两种主要杂质只能通过CAD检测到（图5）。因此，每种方法都提供了单独一种方法无法检测到的相关数据。

结合这两种方法可以对复杂样品进行全面分析，其中未知杂质可能对CAD过于挥发性，但在UV中检测到，或者UV无法检测到，但使用CAD很容易看到。当使用单个校准曲线量化化合物时，此类补充方法提供了更准确的分析[12]。应用这两种方法可以检测所有杂质和相关化合物，提供了一种非常适合稳定性研究的强大的多检测器方法。

结论

LC-UV对复杂混合物中的杂质和降解物进行分解和定量的能力对药品的疗效和安全性监测具有重要意义。杂质和降解物的定量可能具有挑战性，因为标准通常不可用，并且分析物之间的紫外响应可能存在显著差异。为了克服这些问题，开发了CAD-UV方法。然而，CAD反应受梯度洗脱的影响。因此采用了逆梯度补偿方法。对梯度补偿进行了评估，表明其对CAD响应具有显著的益处。因此，使用单一校准剂定量的CAD方法可以成功地用于评估外部标准不可用的杂质水平。

工具书类

1.谁：http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/

2. PubChem:https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/paclitaxel#section=Drug-and-Medication-Information

3.约翰·赖利（John Reilly）、布莱恩·埃弗雷特（Brian Everatt）和克莱夫·奥尔德克罗夫特（Clive Aldcroft）。（2008）在常规反相液相色谱法中实施带电气溶胶检测。液相色谱及相关技术杂志，31:20，3132-3142

4.非物质文化遗产指南： http://www.ich.org/products/guidelines网站

5.英国癌症研究：http://www.cancerresearchuk.org/health-professional/cancer-statistics/worldwide cancer

6.非物质文化遗产指南Q3B：http://www.ich.org/products/guidelines/quality/quality-single/article/inprurities-in-new-drug-products.html

7.Masoom Raza、Siddiquia Zeid、A.Al Othmana、Nafisur Rahmanb。（2017）药物分析中的分析技术：综述。阿拉伯化学杂志。第10卷，补充件1，第S1409-S1421页

8.迈克尔·斯瓦茨。（2010）HPLC检测器：简要回顾。液相色谱及相关技术杂志，33:1130–1150。

9.马格达莱娜·利戈尔（Magdalena Ligor）、西尔维亚·斯图德琴斯卡（Sylwia Studziñska）、阿列舍·霍纳（AlešHorna）和博古斯·瓦夫·布舍夫斯基（Bogusłw-Buszewski）。（2013）电晕充电气溶胶检测：分析方法。分析化学评论。2013年第43卷第2期。

10.塔德乌斯·戈雷基（Tadeusz Górecki）、弗雷德里克·林恩（Frederic Lynen）、罗曼·苏克斯（Roman Szucs）和帕特·桑德拉（Pat Sandra）。（2006）使用带电气溶胶检测的液相色谱的通用响应。分析。化学。，2006年，78（9），第3186–3192页。

11.保罗·加马奇。（2017）液相色谱荷电气溶胶检测

和相关分离技术，Wiley-VCH，5月。

12.孙平（Ping Sun）、王显德（Xiande Wang）、洛丽·阿尔基尔（Lori Alquier）和辛西娅·玛丽亚诺夫（Cynthia A.Maryanoff）。（2008）使用配备紫外线和带电气溶胶检测器的高效液相色谱法测定紫杉醇中杂质的相对响应因子。色谱杂志。第1177卷，第1期，4:87-91。