随着UHPL仪器和UHPL柱技术的进步,UHPL(超高效液相色谱)的采用改变了科学家对色谱性能的期望。本文将讨论液相色谱(LC)在提高分离效率方面的挑战,这导致了UHPLC技术的创新。我们将进一步了解超高效液相色谱,以及超高效液相色谱分离的速度、灵敏度和分辨率优势是如何扩展到常规小分子分析之外的。我们还将讨论超高效液相色谱的发展及其在其他色谱应用领域的扩展,如尺寸排除色谱(SEC)和超临界流体色谱(SFC)。


介绍


UHPLC (Ultra High-Performance Liquid Chromatography) is a separation technology that increases chromatographic speed, sensitivity and resolution, over traditional HPLC separations by providing higher chromatographic efficiency per unit time [1]. The greatest gains are obtained when using columns packed with sub-2-µm particles in narrow bore (< 2.1 mm internal diameter) columns and run at or above their optimal linear velocity using low dispersion instrumentation. However, using columns packed with small particles, and realising the expected gains in efficiency, require improvements to the instrumentation, column hardware and particle technology [1].


通过减少涡流分散和传质对加宽的贡献,填充较小颗粒的色谱柱比填充较大颗粒的色谱塔产生更高的色谱效率[1]。效率与柱的长度成正比,与颗粒大小成反比;通过保持柱长与粒径比(L/dp)相等,可以保持分离的分辨率。使用填充有较小颗粒的较短柱可以减少总运行时间,同时提高灵敏度。图1显示了使用更小、更高效的色谱柱时,在速度和灵敏度方面的色谱改进。


图2显示了在最佳流速下操作时,随着粒径减小,效率的测量增益。与填充较大颗粒的色谱柱相比,填充较小颗粒并以最佳流速运行的操作色谱柱产生更高的色谱柱背压。最佳流速下的观察压力随着粒径的反立方体(ΔP∞1/dp3)而增加。UHPLC仪器泵、阀门和流体通道的改进需要与这些柱产生的增加压力相兼容。


The efficiency gains of a narrow bore column (< 2.1 mm internal diameter) packed with small particles can only be obtained by minimising instrument band spreading. Traditional HPLC systems have large fluidic pathways that are inherent to the design of the injector, tubing, and flow cell. This increased extra-column dispersion dilutes the chromatographic band, which negates the efficiency gains of using high efficiency columns [2]. This effect is more pronounced for early eluting peaks where the peak volume is small and is more impacted by the system band spreading contribution [2]. The impact of this effect increases as the column internal diameter is further reduced. Large bore columns compensate for this effect by increasing the eluting peak volume; the relative ratio of system dispersion to peak volume is reduced as the column volume increases. An often overlooked beneficiary of this is in the application of nano- and micro-flow liquid chromatography. The advantages of low dispersion systems developed for sub-2-µm LC separations are also utilised for nano-and micro-flow LC separations. This development significantly enhances the advantages of the smaller scale chromatographic separation and further increases sensitivity [3]. Figure 3 shows the measured system dispersion values for two systems and contribution of the system dispersion on the chromatography.


在未针对UHPLC进行最佳配置的系统上使用较小的颗粒填充柱可能会带来使用较大颗粒尺寸的柱时不常见的问题。例如,当流动相流经填充床时,由于摩擦加热,柱温升高。这会导致温度在柱长度和半径范围内发生变化。径向温度梯度可以增加谱带展宽[4]。窄孔柱有助于减少径向温度梯度。与大孔径立柱相比,较小直径立柱相对较大的表面积体积比有助于消散摩擦加热。使用窄孔柱和设计良好的柱烘箱以及优化的热控制可以显著提高分离效率和分辨率[4]。


UHPLC颗粒技术


除此之外,用于驱动分离性能的颗粒技术也有了重大创新。多年来,硅基颗粒因其广泛适用于各种分离条件而得到广泛应用。许多用于HPLC的传统硅基色谱柱具有开放孔结构和高孔容的颗粒,这使得它们在UHPLC压力下操作时机械不稳定。乙烯桥杂化颗粒结合了二氧化硅颗粒和聚合物颗粒的特性,是第一个在保持分离效率的同时提高机械稳定性的颗粒[5]。与硅基颗粒相比,杂化颗粒还具有更高的化学稳定性,使其能够在更大的流动相pH范围内使用[5]。硅基颗粒合成技术的创新使制造商能够生产出能够承受超高压PLC工作压力的高强度二氧化硅颗粒。随着高强度二氧化硅的发展,色谱仪能够将基于HPLC二氧化硅颗粒开发的方法转移到UHPLC。表面多孔二氧化硅颗粒是提高分离效率的下一个创新。填充这些颗粒的柱进一步减少了涡流弥散,也减少了纵向扩散[6]。了解这些颗粒技术的发展,使制造商能够提供适用于常规小分子分析以外的其他领域的创新柱,例如尺寸排除色谱法和超临界流体色谱法。


超高效液相色谱法在排阻色谱中的发展


在本讨论中,尺寸排除色谱法(SEC)和凝胶渗透色谱法(GPC)仅在应用领域有所不同。它们都是基于尺寸的分离模式,SEC通常与生物分子分离相关,GPC指合成或天然聚合物的分离。使用较小颗粒柱和低分散流体路径的UHPLC技术的显著改进提高了分辨率,随后两种技术的分析时间都减少了[7,8]。随着生物分子研究的不断创新,科学家需要充分描述和识别样本中可能影响药物疗效或安全性的生物分子物种。在聚合物工业中,聚合物的物理化学性质,如耐化学性或抗拉强度,与分子数据相关,以定制最终用途产品所需的材料特性。对于这些示例,尺寸排除色谱是首选技术。


与小分子分离类似,由于UHPLC系统优化不佳而导致的任何柱外带扩展都会破坏高效分离所获得的收益。对于SEC,分离发生在色谱柱内的孔隙体积内;更重要的是要将额外的柱带展宽的贡献降到最低。因此,首选具有极低系统色散的等容系统。图4显示了两个系统的影响:一个具有高系统分散性,另一个具有低系统分散性。基于UHPLC的低分散系统保持了分离的分辨率,特别是对于低分子量物种。尽管这两种系统使用相同的色谱柱系列,但由于系统分散度增加,高分散系统无法利用使用较小的颗粒色谱柱。


必须将峰值宽度保持在最小值,以保持分辨率;然而,速度是UHPLC的主要优点。与传统的长柱(填充5µm颗粒)相比,填充1.7µm粒子的短柱可以在大约1/9的时间内产生等效的分辨率[2]。在需要更高分辨率的情况下,现在可以更有效地使用更长的色谱柱,而不需要较长的分析时间。此外,溶剂消耗的差异也很大。图4所示的初始分离使用30 mL溶剂,而低分散度UHPLC-GPC系统使用5 mL溶剂。每次分析的成本在分析期间和废物流最终处置期间都会受到重大影响。在这种情况下,使用减少有毒溶剂的用量也可以改善分析员的工作环境。


缺乏为高性能GPC优化的现代柱化学,限制了开发新的、更高效的UHPLC-GPC分离的潜力。为了充分实现较小颗粒色谱柱的效率优势,需要以较高的线速度将流动相泵入色谱床。将此方法用于传统的7.8 mm内径的SEC柱将浪费大量流动相,而色谱效益很小。此外,要实现SEC分离的最大分辨率,需要具有大孔隙体积的固定相。这对小颗粒来说是一个挑战,因为增加孔隙体积会显著降低颗粒的结构完整性。粒子强度差是聚合物基树脂的主要缺点,相对非刚性结构在高压操作条件下会压缩或坍塌。GPC固定相的最新发展使用了全多孔混合颗粒[5],在保持所需的机械刚度的同时提高了分离效率。


证监会的演变


超高效液相色谱分离的另一个最新进展是探索和使用替代溶剂和流动相,以实现分析物的选择性和保留。超临界流体色谱法(SFC)就是这样一个领域,它使用替代溶剂,如液态二氧化碳和甲醇等共溶剂作为流动相。将二氧化碳保持在临界流体区域所需的压力通常在100至400巴之间。二氧化碳是一种高压缩性流体,与通常用于LC的泵送不可压缩流体的系统相比,它对流体和泵送算法的要求更高。系统压力的任何微小偏差都会改变溶剂密度和随后的溶剂强度,从而影响分析物保留再现性[9]。历史上,旧的HPLC仪器技术无法持续输送压缩的二氧化碳,因此该方法的可靠性和重复性受到影响。


大多数LC仪器设计用于传输不可压缩流体,因此在SFC操作条件下难以保持成分精度和流量精度[9]。UHPLC系统工程的改进改变了对泵设计和泵控制算法的理解,以补偿可压缩流体,从而实现可再现的保留时间和极低的基线噪音。此外,与主要受旧技术和等容条件限制的方法相比,梯度SFC分离现在很常见。

系统内的背压调节是实现可靠SFC分离的最重要方面。压力调节不当严重影响流动相密度和由此产生的色谱再现性。传统的SFC仪器受到压力监测能力差和反馈回路反应慢的困扰。通过使用主动和静态压力控制,用户可以精确控制压力和流量,以在所有分离条件下实现高度可重复的结果。在这种情况下,静态控制保持设定的最小压力,而增强型主动控制微调用户所需的设定点。图5显示了系统压力的微小变化对观察到的保留时间的影响。


SFC分离的较高扩散率与较小颗粒相结合,导致分析物在固定相和流动相之间的更快传质。这导致使用高流动相线速度进行高效分离。例如,为正常相条件开发的手性分离现在可以利用SFC显著减少样品运行时间和溶剂成本。图6显示了与传统的基于HPLC的正相方法相比,在保持峰值分辨率的同时,分离速度有所提高。


结论


将填充有小颗粒的色谱柱与低分散度UHPL系统相结合是UHPL技术的关键。小颗粒技术已经存在多年;然而,单靠颗粒无法提供预期的色谱性能提升。系统设计的整体方法考虑了仪器、柱硬件和粒子开发,从而提供真正的UHPLC性能。


UHPLC技术在过去14年的发展使来自不同应用领域的科学家能够推进他们的研究。将起源于小分子理论的超高效液相色谱概念应用于其他色谱技术,如SEC和SFC。SEC和SFC的设计不是为了取代传统的超高效气相色谱技术,而是通过提供不同的分离模式来补充它。独立于应用,UHPLC在减少分析时间、产生更尖锐的峰值以提高灵敏度以及提高分辨率以更好地表征和量化样品成分方面取得了显著进步。


工具书类


1.Dao T.-T.Nguyen,Guillame,D.,Rudaz S.,Veuthey J.,.液相色谱法杂志A,(2006)第1128卷,第1-2期,2006年9月22日,第105-113页。


2.Mazzeo,J.R.,Neue,U.D.,Kele,M.,Plumb,R.S.一种新的分离技术利用了亚2微米多孔颗粒Analyt。化学。77(2005),460A–467A。


3.Rainville P.、Langridge J.、Wrona M.、Wilson I.、Plumb R.《微流控液相色谱与HRMS集成用于分析生物流体中的分析物:过去、现在和未来》。生物分析(2015),7(11),1397-1411。


4.Gritti,F.Guiochon,G.,极细颗粒填充柱的热环境优化,色谱杂志A,(2016)1353-1362。


5.Wyndham,K.D.、O&#39;Gara,J.E.、Walter,T.H.、Glose,K.H.、Lawrence,N.L.、Alden,B.A.、Analyt。化学。75 (2003), 6781 – 6788.


6.Gritti,F.Cavazzini,A.,Marchetti,N.,Guiochon,G.用完全和部分多孔C18-键合硅胶材料填充的色谱柱效率的比较,色谱杂志A,1157(2007)289-303。


7.Jenkins,K.:《尺寸隔离色谱入门指南》,Waters Corp.,Milford,2014年。


8.E.Bouvier,S.Koza,《超高效液相色谱法分离蛋白质和聚合物的研究进展》,《分析化学趋势》,63(2014),85–94。


9.Tarafder,A.、Fountain,K.、Hill,J.、Fogwill,M.、Simeone,J.和Baynham,M.:收敛色谱初学者指南,Waters Corp.,Milford,2017年。


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