利用HPLC/PDA优先于UHPLC改进大麻药效分析方法的开发

随着越来越多的州采取了药物和/或娱乐性大麻使用方案，大麻检测实验室的数量有所增加。当大麻用于医疗或研究时，效力测试尤其令人担忧。因此，大麻主要成分的分析标准至关重要。历史上使用的分析方法在方法稳健性和样本周转时间方面存在缺陷。本手稿描述了一种简单、准确和可重复的分析方法的开发，该方法通过高效液相色谱（HPLC）和光电二极管阵列（PDA）检测，使用SPP（表面多孔颗粒）柱对大麻提取物中的七种主要大麻素进行色谱分离和定量。

介绍

在美国，1970年的《联邦管制物质法》（CSA）规定，出于任何目的使用和持有大麻都是非法的。根据CSA，大麻被归类为附表I物质，这意味着它具有很高的滥用可能性，并且没有被接受的医疗用途，因此甚至禁止药物的医疗用途[1]。然而，在州一级，有关大麻医疗和娱乐用途的政策差异很大，许多州的政策与联邦法律相冲突。

1996年，加利福尼亚州成为第一个将医用大麻合法化的州。此后，更多的州制定了大麻计划，最近的一个州是佛蒙特州，该州于2018年1月将成年人使用大麻合法化。截至2018年3月，29个州、哥伦比亚特区、关岛和波多黎各已颁布公共医用大麻和大麻计划。另有17个州批准了大麻非精神活性成分大麻二酚（CBD）含量高的产品的药用，只要该产品的精神活性成分四氢大麻酚（THC）含量低。这些“高CBD/低THC”计划通常包括对此类产品可用于的医疗条件类型的限制[2]。2012年至2018年期间，九个州和哥伦比亚特区扩大了计划，将大麻的“零售/成人”娱乐使用纳入其中[3]。

随着大麻的合法性和使用在全国范围内的普及，大麻的种植以及同时进行国家规定的大麻作物测试的分析实验室数量也在增加[4]。大麻综合测试涵盖一系列目标，包括THC和CBD、萜烯、微生物和农药污染物以及通过种植过程中土壤吸收的重金属。对于所有这些令人关注的参数，可靠和准确的分析方法对于确保大麻产品的质量、安全和效力至关重要。

当大麻用于医疗或研究时，效力测试尤其令人担忧。因此，大麻主要成分的分析标准至关重要。天然存在的大麻素是大麻植物的主要生物活性成分，形成了一组复杂的密切相关的化合物，其中113种已知，70种已有详细描述。主要关注点是Δ9-四氢大麻酚（THC），这是大麻中的主要活性成分，因为其具有精神活性、药理和毒理学特征，对其实施了严格的法律限制。然而，分析实验室还必须关注Δ9-四氢大麻酚酸（THC-A），这是THC的天然前体，在大麻干燥和/或加热过程中容易脱羧为THC。

许多大麻测试标准化工作都使用了不同大麻素的标准溶液进行方法开发。然而，大麻中化合物的复杂基质与纯标准溶液有很大不同，因此，开发用于整个大麻测试的可重复方法需要使用实际大麻样品[5]。

气相色谱/质谱（GC/MS）历来用于分离和定量大麻中感兴趣的化合物。然而，GC用于大麻素分析的局限性在于区分THC和THC-a。为了获得这两种化合物的不同数据，必须完成一个额外的过程来衍生样品，以便THC-A不会通过注射热转化为THC[6]。

本文描述了一种用高效液相色谱法和PDA检测法分离和定量紫花苜蓿提取物中七种主要大麻素的分析方法。该方法简单、准确、可重复，提供了更短的周转时间，并排除了GC/MS分析大麻成分和超高效液相色谱成本带来的一些挑战。

实验

硬件/软件

A PerkinElmer®（美国康涅狄格州谢尔顿）屈肌™ HPLC系统与PDA（光电二极管阵列）检测器和配套的CDS系统一起使用。珀金·埃尔默·布朗利™ SPP C18，2.7µm，3.0 x 150 mm色谱柱用于所有分析。

LC参数

LC方法参数如表1所示。

溶剂、标准，

和示例

使用的所有溶剂和稀释剂均为HPLC级，并通过0.45µm过滤器过滤。所有稀释剂均为80:20甲醇/水。Δ9-四氢大麻酚（THC）、Δ9--四氢大麻烯酸（THC-A）、大麻二酚（CBD）、大麻二酚酸（CBDA）、大麻酚（CBG）、大麻醇（CBN）和大麻色素（CBC）的1 mg/mL（在1 mL甲醇中）标准品是从Sigma-Aldrich®，Inc.（美国宾夕法尼亚州阿伦顿）和Restek Corporation（美国宾夕法尼亚省贝勒芬特）处获得的。

通过向10-mL容量瓶中添加每种标准品1mL，并填充80:20甲醇/水稀释剂，制备七种标准品的100-µg/mL工作标准品。该工作标准也用作6级校准标准。然后通过工作标准品的连续稀释制备50、20、5、1和0.5µg/mL的校准标准品。

从3B Analytical®（波特兰，俄勒冈州，美国）大麻测试实验室获得四份5毫升制备的大麻提取物样品A至D。实验室通过向一克干燥的研磨大麻花中添加10毫升甲醇来制备提取物。然后将样品涡流三分钟，然后使用0.45-µm过滤器过滤2 mL上清液。然后用甲醇将过滤后的上清液稀释3倍。这导致初始产品的总浓度稀释30倍。收到样品后，用稀释剂将每个样品进一步稀释100倍，并冷冻保存。

这相当大的稀释度需要保持在校准剂的浓度范围内（0.5-100µg/mL）。大麻标准品在商业上（和法律上）只能以1 mg/mL的浓度获得。因此，作为校准混合物的一部分制备后，最高水平的单个分析物浓度为100µg/mL。这一水平大大低于未稀释大麻提取物中某些大麻素的预期水平，尤其是THC-A；因此，样品的稀释要求很高。随后通过0.45-µm过滤器过滤所有校准剂和样品，然后注入（4µL）。

结果和讨论

图1显示了含有七种目标大麻素的标准混合物的色谱图，所有这些都在四分钟内分离出来。梯度渐变是由于高端校准剂的浓度相对较低，再次受到可获得的标准浓度的限制。如图2所示，通过10次重复注射100ppm标准混合物来证明色谱重复性。所有峰的保留时间%RSD小于0.05%。这证实了该色谱方法的可靠性能，这对于确保药用大麻分析结果的完整性至关重要。在药用大麻行业，自信的产品成分对于确保释放产品的安全至关重要。

THC和THC-A的代表性6级线性图如图3所示。所有七种大麻素的R2值均高于0.999。如表2所示，根据校准标准响应为每种大麻素确定了LOQ（定量限）。所有分析的大麻素的LOQ（≥10 S/N）均≤0.10µg/mL。由于大麻素通常进行高端效力测试，因此这些LOQ远低于所分析的主要大麻素的当前浓度。

图4显示了每个样品的色谱结果。比较色谱图，没有任何样品显示出CBN的可检测水平，只有样品A显示出CBC的可检测量。样本A与其他样本的差异在于，样本A中CBDA的比例显著高于其他样本，而THC和THC-A的比例显著低于其他样本。这也是唯一一个含有定量CDA和未知基质成分的样品，在CBDA背面洗脱。否则，样品B、C和D看起来非常相似。

表3显示了每个样品中检测到的七种目标大麻素的浓度。3B Analytical验证了检测到的浓度与基于GC的独立分析得出的预期值一致。样本A显示CBDA浓度明显较高，因此指向一个异常类型的大麻菌株，该菌株可能会因可能的药用目的而引起极大兴趣。样品B显示了THC-A的最高浓度，使其与其他样品区分开来，并使其成为娱乐目的的相对前端通道。样品C和D在色谱和定量上都非常相似，表明它们来自相似的大麻菌株。

结论

本研究证明了使用HPLC和PDA有效地色谱分离和定量大麻提取物中的七种大麻素，包括THC和THC-A。该方法在测试浓度范围内为七种大麻素中的每一种提供了良好的线性，样品结果经验证与独立GC-分析所得结果一致。

使用SPP柱，通过常规HPLC在不到四分钟的时间内完成分离，从而减少了周转时间，避免了与UHPLC相关的更高成本。PDA定量提供了极好的灵敏度，不需要通过质谱进行定量。

致谢

作者感谢3B Analytical的梅根·布洛克（Meghan Brock），感谢她慷慨地准备并提供用于本研究的样品提取物，以及提供产品详细信息以帮助分析和验证样品结果。

工具书类

1.美国司法部、美国缉毒署。缉毒局对大麻的立场。2013年4月。

2.国家立法机关全国会议。国家医用大麻法律。2018年3月28日。http://www.ncsl.org/research/health/state-medical-marijuana-laws.aspx#2。2018年3月29日访问。

3.国家立法机关全国会议。深度潜水：大麻。http://www.ncsl.org/bookstore/state-legistallures-magazine/marijuana-deep-dive.aspx。2018年3月29日访问。

4.Tulsi，B.大麻检测服务的光明未来。实验室经理11（9）：10-16。2016年10月。

5.Egerton，D.在绿色市场中定义大麻标准。2017年2月17日。https://www.labcompare.com/10-Featured-Articles/333962-Definiting-Ganabis-Standards-in-a-Green-Market/。2018年3月29日访问。

6.James，A.气相色谱法：大麻分析的有力工具。今日色谱法11（1）：40-43。2018年2月/3月。