长春应化所杜衍&李应福Angew：基于商品化验孕试纸的免分离核酸检测平台

研究背景

现场即时检测（point-of-care testing，POCT）是在采样现场进行的、利用便携式设备及配套试剂快速得到检测结果的新方法，具有便携、成本低、上样量少等优点，对于传染病和人类疾病的快速诊断尤为重要。

近年来，利用现有便携式设备来检测核酸、蛋白及小分子等得到了科研人员的广泛关注。例如，将功能核酸作为识别元件，利用血糖仪检测DNA、温度计检测可卡因、验孕试纸（PTS）检测病毒基因等。

然而，这些检测一般都需要使用特殊的底物来产生信号或者需要借助磁珠等材料来分离反应产物。以验孕试纸为例，它是一种检测人绒毛膜促性腺激素(hCG)的侧向层析试纸条，其工作机制如图1所示。

存在hCG时，会产生检测线和控制线两个条带；反之，只有控制线变红。当其用于DNA检测时，需要四个步骤，包括在磁珠上制备传感界面、靶细胞孵育、磁性分离上清液并洗涤以及PTS测量等。因此，这种方法不利于实现终端的便携式诊断。

图1 验孕试纸工作原理示意图

文章简介

基于上述问题，中国科学院长春应用化学研究所杜衍研究员与麦克马斯特大学李应福教授团队利用简便快速的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术、特异的立足点介导核酸链置换技术（toehold mediated strand displacement）、可与具有互补序列的DNA探针杂交的微米级DNA纳米花（DNA NF）以及1：1单价态偶联的蛋白质核酸（hCG-DNA）标记技术，合作构建了基于商品化验孕试纸（PTS）的免分离、一步核酸检测新技术（图2）。

作者将治疗乙肝病毒（HBV）的药物拉米夫定（LAM）和恩替卡韦（ETV）相关的单碱基突变位点rtL180M作为靶基因，野生型基因rtWT作为对照，针对其LAMP扩增产物的环序列设计了三通探针3wj（由hCG-P1、L180M-P2、P3构成）并固定于DNA NF基底上。利用DNA NF在侧向层析试纸上不流动的特性，当靶基因不存在时，反应物不能在PTS上流动产生信号；当正确基因的扩增产物存在时，三通探针中hCG-P1被释放出来，在PTS上流动而产生阳性信号。

图2 (A) LAMP扩增产物示意图; (B) L180M-3wj与LAMP扩增产物反应示意图; (C) 商品化验孕试纸用于DNA NF辅助的HBV耐药突变基因一步诊断示意图

将不同浓度基因的LAMP扩增产物与3wj-DNA NF混合孵育，插入试纸条后2 min进行拍照。由图3可见，在靶基因rtL180M的LAMP扩增产物存在下，试纸条呈现明显的两条红线，可检测至2拷贝/微升；

而在野生型基因rtWT存在时，其检测线与控制线的相对信号强度几乎与靶基因不存在时相近，表明该方法具有良好的灵敏度与特异性。并且，该检测在5%的血清中也没有信号的损失，体现了该检测平台的抗干扰能力

此外，在临床样本的测试中，试纸条检测结果与荧光检测法、直接测序法结果相匹配，表明该方法的可靠性与实际应用的潜力。

图3 验孕试纸对rtL180M和rtWT扩增产物在(A)缓冲液、(B)5%血清中的响应；(C)验孕试纸、(D)荧光法对无模板阴性对照和四例临床样本的响应

原文链接

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202108827

DOI 10.1002/anie.202108827

小结

该平台具有以下优点：

1）检测灵敏度高，可检测低至2拷贝/微升的基因；

2）特异性好，能够高度区分HBV的野生型基因（rtWT）与rtL180M耐药突变型基因；

3）可实现临床样本的检测，检测结果准确可靠；

4）3wj-DNA NF探针冻干后具有良好的室温存储能力，一个月后探针活性保持原来的82.3%。

这是首次将PTS、LAMP、链置换技术与DNA NF结合起来，所构建的简便、免分离的“信号开”型核酸检测新方法，得益于DNA NF与L180M-3wj的高效杂交与LAMP扩增产物对hCG-P1的有效置换。鉴于其广普性，该平台可用于检测各种病原体和人类疾病相关的遗传变异。