使用更小的创新粒子快速分析生物分子

摘要

现代生物液相色谱固定相必须提供高分辨率、快速方法、高鲁棒性和高批重复性，以获得可靠的结果。此外，BioLC中常用的分离模式也面临着不同的挑战。这些要求可以通过优化尺寸和类型的最先进颗粒来满足。本文描述了针对不同生物物质的选定解决方案。

介绍

生物液相色谱的要求不同于小分子分析中遇到的要求。例如，分析物通常具有较高的分子量（MW）和较大的流体动力体积。由于蛋白质或抗体等物质的体积增大，它们也极为疏水。此外，密切相关的化合物必须相互分离，包括聚集体或片段中的单体，翻译后修饰的天然化合物，或副产品中的目标化合物，例如含有附加/缺失氨基酸或核苷酸的副产品。

由于各类生物分子的研究活动不断扩大，以及大量生物化合物进入商业市场，必须在质量控制实验室（QC）进行分析，因此对生物活性炭产品的需求不断增加[1]。因此，需要更快的分析解决方案来提高样品吞吐量。正如在小分子质量控制实验室中遇到的那样，需要可靠、稳健和可重复（超）高效液相色谱（U）产品，以确保这些产品进入商业空间的高质量标准。

在过去几年中，根据用户在研发和质量控制环境中的需求，BioLC的超高效液相色谱柱市场不断增长[2]。针对不同类型生物分子的解决方案现已问世：肽和蛋白质、单克隆抗体（MAb）和抗体药物结合物（ADC）以及寡核苷酸和核酸。为了分析这些化合物，可以使用各种分离模式的产物：反相（RP）、尺寸排除（SEC）、离子交换（IEX）和疏水相互作用（HIC）。不同基材的小颗粒确保快速运行和不同的检测选项，如UV、MS或MALLS（多角度激光散射）。

基于混杂颗粒的RP超高压液相色谱柱

在RP中，UHPLC应用的亚2µm颗粒已成为多年来的标准。由于生物分子的要求不同于小分子，因此更大的孔径和更高的温度耐受性至关重要。这允许分析大蛋白、抗体和强疏水性化合物，这些化合物需要通过短链修饰的宽孔相提供较低的疏水性。此外，颗粒稳定性和机械稳定性是强制性的，由于遇到高压，这在UHPLC中非常具有挑战性。

一般来说，采用较高的分析温度通常对色谱结果有有利影响；例如提高分辨率或增加峰值容量。较高的柱温降低了流动相的粘度，使化合物能够更容易地进入孔隙并与颗粒表面相互作用，并减少了对颗粒表面的吸附。温度可以影响蛋白质的结构和扩散速率，因此可以有效地提高性能。

由于颗粒遇到更高的背压，因此很难生产出亚2µm的UHPLC颗粒，因此必须比较大的颗粒对应物更加坚固。确保颗粒能够承受这种高压的一种可能方法是降低二氧化硅颗粒的孔隙率，这反过来会导致表面积非常低，并且会以较低的分辨率为代价[3]。除了与压力相关的颗粒强度挑战外，还必须解决固定相的热稳定性问题。

这里提供了不同的解决方案。取代传统的硅基颗粒，生成的有机/无机杂化二氧化硅颗粒在其二氧化硅主链中含有乙烯桥。这提供了较高的机械强度和更大的化学稳定性，从而实现了高温耐受性（高达90°C）和工作pH值范围从1到12。对于肽或寡核苷酸，这些高比表面积颗粒（120º的标准≥300 m²/g）的标准孔径为120º，对于较大的肽或抗体，其大孔径为300º。此外，由于采用了多步骤封头工艺，颗粒表面具有增加的惰性。

目前，在这些有机/无机混合硅胶柱中，可以对BioLC进行四种不同的改性（YMC-Triart/YMC-Treart Bio，YMC Co.Ltd.，日本京都）。这些固定相可用于粒径为1.9µm的UHPLC，并可完全扩展至3或5µm。具有120μ孔的C18是肽、肽图谱或寡核苷酸分析的理想选择。C8柱（120º）允许更短的运行时间，特别是在寡核苷酸分离中。宽孔Bio C18专用于较大的肽或蛋白质，而Bio C4（均为300μl）不仅可以分离大蛋白，还可以分离完整的MAb（图1）。

除了不含任何金属杂质的惰性基体颗粒外，还可以优化柱壳的惰性。为此，可提供生物惰性、无金属的硬件。通过使用PEEK内衬不锈钢柱体和PEEK玻璃料，消除了与硬件的任何交互作用，同时保持了柱的压力稳定性。

对惰性有特殊要求的SEC柱

SEC中的分离原理完全基于MW，更具体地说，是流体动力体积，以及孔隙的可接近性，而与固定相没有实际的相互作用。必须避免任何二次相互作用，以免影响SEC分离。因此，SEC固定相越惰性，相应结果的重现性就越高。由于分离机理，需要更大的柱体积和更低的流速，这导致分析时间更长。减小颗粒大小可以缩短色谱柱和减小色谱柱内径，从而减少运行时间，同时保持甚至提高分辨率。

超高效液相色谱（UHPLC）中2µm或更小的SEC粒径非常难以生产。与RP类似，提供更高耐压性的典型方法是降低孔隙率或使用不同的基材，如上文所述的RP的混合材料。除了前面所述的障碍外，第二种方法的缺点是惰性降低，因为基本粒子的有机成分可以提供不希望的二次相互作用[4]。还必须考虑使用小于2µm的小颗粒的另一个方面，因为压力升高会导致色谱过程中聚集物的形成增加，从而改变样品中的实际聚集率[5]。

硅基SEC相通常具有二醇改性（例如YMC-Pack diol或YMC-SEC MAB），具有最高的惰性。不同的孔径和粒径组合涵盖从小肽到抗体及其聚集体的不同分析物类型。颗粒有3和5µm可用于HPLC分离。两种最常见的孔径颗粒为200和300？，Diol-200和Diol-300（例如MAbs）也作为2µm颗粒生产，用于UHPLC目的。这些2µm颗粒与较大颗粒具有相同的孔隙度和性能（图2）。因此，它们不仅允许开发新的和改进的方法，而且由于在不同粒径上使用相同的颗粒特性，现有HPLC方法对UHPLC的线性缩小。

为了进一步提高色谱柱的惰性，最好抑制任何二次相互作用选项。即使固定相本身是惰性的，使用的硬件也可能有影响。因此，使用PEEK内衬不锈钢柱体等生物惰性硬件可能是一种可行的方法，目前正在评估中。

HIC色谱柱设计用于高通量

疏水相互作用色谱法（HIC）是一种标准技术，用于测定抗体药物结合物（ADC）的药物抗体比（DAR）[6]。因此，HIC方法通常用于ADC的质量控制目的。因为质量控制部门需要高吞吐量，并且需要通过使用较小的颗粒尺寸来实现更短的运行时间。

在HIC中，基于聚合物的固定相根据疏水性分离物质，通常使用反向盐梯度使高浓度共沸盐盐析出的蛋白质重新水化。尽管可以使用更稳定的无孔颗粒，但市场上大多数产品的压力规格通常限于200巴，以避免颗粒变形和由此导致的性能损失。因此，必须使用较低的流速，这会导致较长的保留时间，而这与较高的吞吐量相反。

为了克服这一缺点，开发了一种新的固定相（BioPro HIC HT，YMC），该固定相基于无孔聚甲基丙烯酸酯颗粒。丁基结合颗粒具有2.3µm颗粒，用于分析生物分子，尤其是ADC。这一非常刚性的阶段不同于其他阶段，因为它允许更高的流速，因此运行时间更短，因为它的压力稳定性高达400巴（是其他商用阶段的两倍）。

使用BioPro HIC HT，对于已经非常快的ADC（如Brentuximab vedotin）的DAR测定分析时间，可以通过应用2.4倍的高流速进一步减少到6分钟，同时保持高分辨率

（图3）。这使得样品吞吐量提高了2-3倍，这在竞争柱中是不可能的，因为压力限制低得多，只有200巴。

IEX中较小的粒子是理想的解决方案吗？

一般来说，聚合物基颗粒也用于IEX，特别是用于MAb的电荷变化分析。在这种情况下，使用与HIC色谱柱相同的颗粒技术，但对IEX色谱进行了优化。带有季铵或磺酸基团的强交换剂有多孔（BioPro IEX QA/SP，YMC）或无孔（BioPro-IEX QF/SF，YCC）两种类型。多孔型（5µm）允许高样品负载和高分辨率，而无孔相在通常用于QC分离的低样品负载下提供卓越的效率。无孔交换器有5或3µm颗粒。

尽管与上述分离模式相比不太明显，但较小的颗粒尺寸仍能提高IEX的分辨率。另一方面，背压要高得多（图4）。因此，并非所有应用都能从使用较小颗粒中受益。根据流动相的不同，背压可能接近3µm色谱柱的压力极限，分离效果也不会有太大改善

进一步[7]

与其他IEX色谱柱相比，5µm无孔BioPro IEX QF/SF色谱柱具有更高的性能（图5）。由于背压较低，通常可以应用较高的流速，同时保持所需的分辨率。这一事实以及颗粒的稳定性和再现性使5µm无孔交换器成为质量控制的理想选择。

结论

使用更小的现代颗粒通常可以缩短分析时间，从而提高BioLC中通常使用的所有分离模式的样品吞吐量。随着治疗性生物制品数量的增加，这受到了研发和质量控制实验室的欢迎。基于不同颗粒技术和材料的现代解决方案提供了大多数BioLC分离所需的灵活性，并且取决于所采用的分离模式，可用的小颗粒尺寸（1.9至3µm之间）可实现高分辨率和每个模式的快速运行时间。