单克隆抗体重组蛋白等蛋白质生物药物已成为治疗癌症和自身免疫性疾病等威胁生命的疾病的重要疗法。美国和欧盟批准了近250种产品供人类使用,销售额达1400亿美元[1,2]。此外,目前有2000多种蛋白质生物制药正在临床开发[2]。蛋白质疗法是一种大型、异质性药物,在重组表达、纯化和长期储存过程中会受到各种酶和化学修饰,因此其复杂性远远超过小分子药物。解开这种复杂性意味着巨大的分析挑战。本文进一步反映了ChromSoc生物分离进展会议(Medimmune,Cambridge,2015年5月12日至13日)上的发言,描述了蛋白质生物制药结构表征的常见色谱和质谱(MS)策略。


重要特征,如氨基酸序列和组成、分子量和结构完整性、N-和O-糖基化、N-和C-末端加工、S-S桥、游离半胱氨酸残基、脱酰胺(天冬酰胺、谷氨酰胺)、天冬氨酸异构化、氧化(蛋氨酸、色氨酸)、剪切、序列变体、电荷变体、,聚合以及高阶结构信息可以从生成的色谱和质谱数据中提取出来。这通常需要在蛋白质、肽、氨基酸和糖的不同水平上进行评估[3]。为此,有多种色谱模式可用于处理所研究分子的不同物理化学性质。图1概述了在不同级别执行的分离,提供了对上述功能的访问。用于治疗HER2阳性乳腺癌的重磅炸弹单抗Herceptin用于说明目的。在评估特征时,反相液相色谱(RPLC)、离子交换色谱(IEX)、尺寸排除色谱(SEC)、疏水相互作用色谱(HIC)和亲水相互作用色谱法(HILIC)发挥了重要作用(3)。


蛋白质水平

在蛋白质水平上可以揭示上述各种特征。蛋白质水平是指还原或酶切后生成的完整蛋白质或其大片段。就单克隆抗体而言,大片段代表木瓜蛋白酶裂解后生成的二硫键、抗原结合(Fab)和结晶片段(Fc)减少后生成的轻链(Lc)和重链(Hc),化脓链球菌(IdeS)胃蛋白酶或免疫球蛋白降解酶裂解后产生的F(ab’)2和Fc/2。这种裂解策略背后的基本原理是,分子通常更容易接受色谱和质谱测量,并且特定的修饰可以很容易地追溯到特定的领域。

RPLC是表征工作流程中最常用的色谱模式之一。RPLC基于疏水性分离蛋白质,两种类型的相互作用有助于色谱过程,即疏溶剂作用和静电作用。后者由离子点火添加剂控制。当使用宽孔全孔(亚2µm)或浅孔颗粒,结合升高的柱温(80°C)和三氟乙酸(TFA)作为离子点火试剂时,可以在完整的mAbs(±150 kDa)、F(ab')2(±100 kDa,Fc/2和Fd'(±25 kDa)(图1)[3,4]。此外,使用的条件与质谱法兼容,可以识别观察到的。图2显示了Herceptin的还原和非还原IdeZ消化液的LC-MS分析。马链球菌ssp兽疫链球菌中的IdeZ或免疫球蛋白降解酶是一种高度特异的蛋白酶,类似于IdeS,在铰链区域下方的单个位点裂解单克隆抗体,产生F(ab')2和Fc/2片段[5]。在使用三(2-羧乙基)膦(TCEP)还原后,F(ab')2片段转化为Lc和Fd'。顶部观察UV色谱图,底部观察与UV数据同时获得的不同注释峰相关的反褶积四极飞行时间(Q-TOF)MS光谱。峰a对应于单克隆抗体的Fc/2部分,并且存在一些具有特征性146 Da和162 Da间距的糖型,表明岩藻糖和半乳糖,因此强调了N-糖基化。发现四种主要糖类含有典型的哺乳动物复合物类型N-聚糖,称为G0、G0F、G1F和G2F。测量糖基化对单克隆抗体至关重要,因为这是一个关键的质量属性,可以影响产品的安全性和功效。请注意,所有四种糖形体的质量偏差均低于10 ppm。在减少的样品中,Fc/2糖类物质的质量增加了4Da(峰值c)。这可以解释为两个内部S-S桥的减少加上四个质子。峰值d的分子量为23443.5,可以确定为Herceptin的完全还原轻链。部分分解的峰后e的分子量为23444.8,仅高出一Da,代表Lc的脱酰胺变体。值得注意的是,这种细微的质量差异可以被揭示出来。

与RPLC相比;SEC、IEX和HIC是非变性技术,为之前的色谱模式提供补充信息。由于在流动相中使用非挥发性盐,这些模式通常与MS不直接兼容。峰的识别需要在MS测量之前收集并随后进行脱盐或稀释。例如,可以使用与质谱联用的小型RP盒,以自动方式对收集的馏分进行脱盐。

SEC是效率或分辨率最低的色谱模式,但在测定聚集和碎片方面非常强大。人们认识到,聚集体可能会刺激免疫反应,因此测量这一关键质量属性非常重要。SEC通常使用中性pH下的高离子强度磷酸盐缓冲液,将其等速输送至填充有固定孔径颗粒的色谱柱中,该色谱柱按大小控制分离。图1显示了在商业赫赛汀批次中以0.4%检测二聚体,说明了该方法的灵敏度。

IEX是一个很好的工具,可以突出显示可能由修饰引起的带电变体,如脱酰胺、赖氨酸截断、N末端环化等。赫赛汀(图1)阳离子交换(CEX)色谱中观察到的前峰对应于轻链中的天冬酰胺脱酰胺。脱酰胺使蛋白质更酸性,这解释了其在CEX上的早期洗脱。这种分离利用pH 7.6的磷酸盐缓冲液,在此条件下,单克隆抗体带正电荷,并与阳离子交换器的带负电荷功能相互作用。采用NaCl梯度进行洗脱。图3显示了木瓜蛋白酶消化的Herceptin的CEX分析[6]。由于与完整抗体相比,Fab和Fc片段的等电点较低,因此在较低的pH值下进行分离,即pH值为5.6,而完整抗体的pH值为7.6。为了揭示不同峰的一致性,在在线脱盐后用质谱收集并分析馏分。图3显示了反褶积光谱,提供了大量的结构细节。Fab片段的脱酰胺和Fc糖基化被证明。

近年来,HIC主要从抗体药物结合物(ADCs)的角度重新审视,ADCs控制基于结合药物数量的分离,以确定药物抗体比(DAR)。在分离裸单克隆抗体时,突出氧化、天冬氨酸异构化、脱酰胺、琥珀酰亚胺形成、C-末端赖氨酸和剪切引起的异质性是有用的。HIC中的流动相由盐析剂组成,盐析剂在高浓度下通过增加溶质和固定相之间的疏水相互作用保留蛋白质。结合蛋白通过降低盐浓度洗脱。图4显示了在HIC柱上对木瓜蛋白酶消化的无应力和高pH应力Herceptin的分析。Fab片段中的脱酰胺事件明显突出显示,这与图3所示的CEX曲线一致。已知高pH值会导致脱酰胺。


肽水平

蛋白质测量非常强大,但无法提供完整的图像。虽然它可以指示身份并突出主要修饰,但它通常不能提供实际的氨基酸序列,也不能充分确定修饰的位置。在用例如胰蛋白酶水解精氨酸或赖氨酸残基的肽C末端后,在肽水平上提供了进一步的结构细节。Herceptin消化物的高效RPLC分离如图1所示。与蛋白质分析类似,这种分离得益于使用表面多孔的C18颗粒、高温(60°C)和使用TFA作为离子注入试剂。当将这种分离与质谱联用时,在我们的Q-TOF-MS中,超过98%的Herceptin序列被覆盖,从而确认身份。除了识别肽外,肽图中还富含修饰肽。一些水平降至0.1%,其他水平更为显著。图5显示了肽图中所选修饰肽的提取离子色谱图。特别有趣的是位于轻链中的肽ASQDVNTAVAWYQQKPGK。该肽包含四个潜在的脱酰胺位点(3Q和1N)。根据MS测量,无法区分这4个位点。如果要确定实际的脱酰胺位点,有必要对肽进行MS/MS测量。根据生成的碎片离子,脱酰胺作用可以追溯到N。这种脱酰胺作用实际上对应于使用RPLC、CEX和HIC在完整mAb、Fab和Fd'水平上观察到的脱酰胺作用。使用这些技术,脱酰胺不能追溯到特定的残留。在肽水平上工作并执行MS/MS将脱酰胺与特定残基联系起来。


聚糖水平

糖基化可以在蛋白质和肽水平上显示出来。为了更详细地了解聚糖本身,建议将其从蛋白质中去除并进行测量。聚糖分析首先使用PNGase F从蛋白质骨架中释放糖,然后使用2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记,以改进色谱和检测性能。标记糖随后通过HILIC进行分析,并在线进行荧光和MS检测。荧光检测主要用于定量目的,质谱用于鉴定目的。图1显示了在HILIC柱上分离的2-AB标记的Herceptin N-聚糖的荧光色谱图。这里的色谱原理是基于在固定相和流动相周围形成的水层之间的亲水分配。如果流动相中没有水,则HILIC原理不适用。通过增加含水量实现洗脱。可以获得高效的分离,并且可以分解异构体。由于HILIC使用MS友好的流动相,因此可以通过MS和MS/MS测量来确认每个峰的身份。


氨基酸水平

氨基酸分析仍然广泛用于准确量化蛋白质和确定氨基酸组成。在第一步中,通过酸水解(110℃,24 h,6 N HCl)释放氨基酸。随后使用邻苯二甲醛(OPA)对一级氨基酸进行自动柱前衍生,使用9-芴甲基氯酸甲酯(FMOC)对二级氨基酸(脯氨酸)进行自动柱上衍生。衍生氨基酸随后通过RPLC分离并通过荧光检测。图1显示了赫赛汀酸水解物中OPA/FMOC衍生氨基酸的分析。

结论

本贡献报告了蛋白质生物制药特征化的常见策略。表征这些异质分子巨体需要广泛的方法以及多层次的方法。虽然所示的所有示例都与单克隆抗体有关,但对其他重组蛋白也进行了类似的工作流程。色谱法和质谱法的使用超出了专著中讨论的示例,即用于评估药代动力学(PK)特性(7)、克隆选择(使用蛋白质A)(8)、确定高阶结构(氢/氘交换)(9)、鉴定和量化宿主细胞蛋白质(HPC)(10)等。


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