分散对快速色谱分离的实际影响

分散性通常是投资分析设备时需要考虑的重要标准。柱格式应适合系统的体积，以便从固定相获得合理的色谱性能。然而，在实际应用中，我们是否需要关注达到最小分散体积以获得最佳色谱，尤其是快速弹道方法？

介绍

当峰带通过色谱系统迁移时，分析物具有抛物线流，其中峰带因与管壁的摩擦和其他力而扭曲。这些组件可以分为两部分；额外列和列内加宽。柱内作用力发生在多孔颗粒中，而额外的柱加宽被分配给液相色谱（LC）系统。液相色谱系统成分的分散效应可能会对色谱性能产生不利影响。这些元件包括注入口、回路、油管、阀门、配件、检测器和数据采集速率（图1），适用于等容系统和梯度系统。与早期洗脱化合物相比，在使用恒定流动相的等度分离中，在较晚的洗脱峰上观察到分散更大的危害。

The conventional HPLC with totally porous particle, 5 μm, 150 or 250 x 4.6 mm column formats are typically unaffected by dispersive effects as the peak variance caused by the column is greater than the variance caused by the LC extra-column components [1]. However, with the advancement in technology, including narrower bore columns, smaller particle sizes, and higher-pressure LC systems, the discussion regarding dispersion needs to be readdressed. Characteristically, conventional HPLC systems are not optimised where wider bore tubing is used, thus dispersion is measured at greater than 20 μL (Table 1). Nowadays, there are more LC system options available, where there are both UHPLC and UHPLC-Like systems available (please refer to Table 1 for differences). UHPLC systems are designed for greater throughput, performance and speed, and as such, requires the minimum possible extra column band broadening (<10 μL). The UHPLC-Like system offers greater capacity and performance than conventional HPLC, but without the added challenges associated with UHPLC analyses, thus the system can have a dispersion value of <15 μL.

分散的影响可能会导致色谱性能损失、峰宽增加，从而导致分辨率损失

在快速分离中可能对关键对有害。然而，离散度需要优化到什么水平？本文将提供一种估算额外柱带展宽的方法，并评估不同参数对理论%效率产率的影响。

实验

为了评估分散度和系统体积，应用了以下实验参数：使用泵分别按51:49（v/v）的比例分配水和甲醇。使用零死体积（ZDV）接头代替色谱柱，将流速设置为0.1 mL/min。采样频率设置为40 Hz，以充分描述在254 nm（8 nm）参考360（100）处采集的峰值和数据。制备1%丙酮溶于水/甲醇（51:49 v/v）的样品，并在系统充分平衡后进行9次色谱分析。注射体积为0.5μL，柱温控制在40°C[3]。

在岛津Nexera XS UHPLC系统上进行LC分离，该系统配备有二元泵（LC-40D XS）、比例阀、脱气器（DGU-405）、具有冷却能力的自动取样器（SIL-40C XS），柱烘箱（CTO-40C）和光电二极管阵列检测器（UHPLC-PDA或HPLC-PAD）。系统控制器集成到二进制泵中。安装了一个20μL三维微反混合器。

分散的影响

分散度可以通过将丙酮样品注入ZDV接头来测量，以量化额外的柱带展宽效应。方法条件见实验部分，图2中给出了具有不同系统体积和带宽的仪器示例。

为了确定仪器带宽，应记录半高时的保留时间（tR）和效率（N）。这些可以插入到公式1中，以计算σ（σ），进而可以计算仪器带宽（4σ，公式2）。因此，也可以通过本试验将丙酮的平均保留时间乘以流速（等式3，μL/min）来确定系统体积。应记录九次重复测量，以产生具有统计意义的结果。

什么影响分散的影响？

保留系数，k

峰值带在系统中的迁移速度对色散的影响很大。比较了粒径为1.7μm、保留因子k为2、5和10（保留因子的最佳区域，如Purnell基本分辨率方程所述）的50 x 2.1 mm柱格式的%效率产率。UHPL、UHPLC-Like和HPLC系统的分散区域也显示在图表上（图3（a））。带有1.7μm颗粒的50 x 2.1 mm柱格式适用于UHPLC分析，是最苛刻的评估条件，因此，任何其他柱都具有更好的性能。

评估的k的最大值

(k = 10) achieved >90% efficiency yield for dispersion <13 μL. A k of 5 could achieve above 90% of the efficiency yield at the smallest dispersion values (<7 μL). The minimum retention factor of 2 was below 80% thus indicating that greater retention factors should be applied to achieve adequate chromatographic performance. In comparison, a HPLC column format (150 x 4.6 mm, 5 μm particle), with a k of 2 was mostly unaffected by the extra column band broadening, where the % efficiency yield was greater than 90% up to maximum 40 μL of dispersion assessed.

立柱尺寸

当两个参数之间的比率发生变化时，对于具有较小列体积的列格式，分散的影响被放大（图3（b）和（c））。因此，正如预期的那样，柱长越长或内径越宽，受分散影响越小。保留因子保持在5，粒度标准化为1.7μm。结果表明，内径的影响最大，其中4.6mm内径在30μL分散液下的效率产率大于90%。对于UHPLC和UHPLC-Like型系统，3.0 mm内径是降低流速、溶剂消耗和更快运行的良好折衷方案。2.1 mm内径要求通过减少管道体积、管道内径、优化流动池并可能拆除柱切换阀来优化LC系统。

颗粒大小

色谱柱的效率越高，分散体积产生的负面影响就越大（图3（d））。该图说明了这一点，其中最小的1.7μm需要最优化的UHPLC系统，而3和5μm使用高达UHPLC-Like的系统实现了更大程度的预期效率。同样，保留因子标准化为5，柱格式设置为50 x 2.1 mm，因此，如果内径或柱长度增加，这也将为提高效率提供额外支持。本理论研究采用全多孔颗粒，其中表面多孔颗粒具有不同的颗粒结构，从而改变其扩散路径，从而降低降低的板高度。

结果表明，为了获得合理的效率，必须将列格式与仪器匹配。带有可变容量注射器和SPD-M30A毛细管流动池的Nexera XS标准带宽为6μL，但也可以使用回路注射器进行进一步优化。然而，当追求更低的分散体积时，可能会产生对系统稳健性不利的后果。固定回路注射器可能会产生较大的携带，这可能会妨碍准确和可重复的定量数据。使用窄口径油管也可能存在潜在问题。不锈钢管可以通过不同的路径制造，但是，管子有一个公差，管子越窄，误差的影响越大，因此必须有可复制的管子来源。此外，超窄口径油管将增加液相色谱系统（不包括色谱柱）的固有背压。压力变化会导致既定方法中的压敏峰移动，从而改变分析物之间的分辨率。最后，窄口径油管容易堵塞，特别是当样品基质变脏或甚至来自流动相制备时。

虽然使用固定环和窄口径管可以减少额外的柱带展宽，但从实际角度来看，是否需要将色散降低到~5μL这样的极端值，并增加复杂性？在UHPLCC18柱（50 x 2.1 mm，1.7μm，图4）上使用弹道梯度对一系列烷基苯酮进行色谱分析。在一个具有6μL额外柱带展宽和添加体积以将分散度增加至15μL的LC系统上评估了七个峰。结果表明效率有所提高。在UHPLC-Like和UHPLC条件下，10%高度的峰值宽度减少了7.9%，而峰值容量增加了8.4%。然而，这并不像预期的那么显著。弹道梯度通常以大于最佳线速度的流速进行。尽管在van Deemter[4]中，1.7μm粒径的C项更平坦，从而提供了更宽的最佳线性速度范围，但流速仍会比分散效应产生更大的影响。因此，虽然理论上可以显著降低色散，但其他因素在影响效率方面发挥着更关键的作用，因此带宽的改善可以忽略不计。

结束语

简单快速的测试可以很容易地提供有关额外柱带展宽（称为色散）以及系统体积的信息。这些信息提供了有关该系统合适的列格式的关键信息，可以节省购买昂贵的列。例如，在HPLC配置中，UHPLC柱格式永远无法实现其全部色谱潜力，因此，应采用适当优化的系统。

2.1 mm柱内径最适合分散度小于12μL的系统，这可以在经过优化的UHPLC或UHPLC-Like系统上实现。3.0 mm柱格式最适用于UHPLC类仪器。4.6 mm内径的%效率产率在很大程度上不受小于40μL的分散液的影响，即使保留因子为2，因此HPLC系统是最兼容的。

尽管2.1 mm色谱柱格式确实需要最小的额外色谱柱频带展宽，但还有其他因素可能影响获得合理的效率，例如在最佳流速下操作。这对预期收益的影响比减少分散的影响更大。因此，尽管必须使用最小带宽进行操作，但实际意义表明，还有其他因素可能发挥更大的作用，从而减少过度减少色散的影响。

大多数实验室都希望将健壮性与性能结合起来。可变体积Nexera XS系统可以以出色的性能实现出色的分散性，然而，如果认为有必要，可以通过引入固定回路自动采样器和超窄管道来进一步推动它。然而，随着这些变化，它会对任何LC系统的坚固性产生负面影响。应结合仪器的目的和列格式彻底考虑这些因素，以真正达到预期结果。