合成的寡核苷酸在许多疾病中都是极有希望的生物制药候选药物。这就是为什么沉默RNA（siRNA）、信使RNA（mRNA）和反义寡核苷酸（ASO）等核酸疗法在当前研究中越来越受到重视的原因。


合成寡核苷酸所必需的磷酰胺

磷酰胺是化学合成寡核苷酸、核苷酸短片段和类似物的重要组成部分。为了防止在寡核苷酸合成过程中残留反应位点（如羟基和氨基）发生任何副反应，需要保护这些基团。因此，高活性天然核苷酸被四个不同的保护基团修饰。


苯甲酰基（Bz）或异丁酰基（iBu）保护碱的氨基。这只对核苷酸腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶是必需的，因为它们都有初级氨基，否则会附着到另一个核苷酸上。对于胸腺嘧啶，不需要这个保护基团，因为它只有一个活性较低的二级胺基团。糖部分的5'-羟基由二甲氧基三烷基（DMT）保护。抑制糖部分3'-羟基的副反应由两个基团执行：一个二异丙基氨基和一个2-氰基乙基（CE）基团连接到磷酸盐原子。第一个图显示了使用腺苷基磷酰胺的示例的保护基团。


用YMC-Triart混合硅胶柱进行RP或NP模式分析

化学寡核苷酸合成分为四个主要步骤：磷酰胺的脱烷基化、偶联、氧化和封端。在此过程中，可能会出现错误，这就是为什么需要密切监测磷酰胺的纯度。在这个申请说明两种不同的分离模式-反相（RP）和正相（NP）-用于分析四种不同的磷酰胺。由于这些分子的复杂性，可以使用不同的相互作用来实现合理的保留和拆分。由于磷酰胺盐在磷原子上具有手性中心，因此存在两种异构体，导致色谱图中出现双峰。


所有分离均使用高度稳健的YMC-Triart列这是现代生物色谱应用的理想选择。对于RP分离，使用YMC-Triart C18色谱柱。通过施加高达95%B的梯度，仅在中等温度下获得尖峰。由于YMC-Triart C18采用特殊的多级封头工艺，因此未发现尾矿。


除了使用RP色谱的疏水相互作用外，还可以通过使用NP条件聚焦于极性相互作用来分离磷酰胺。使用了YMC-Triart SIL柱，该柱基于裸混合二氧化硅。


尽管这些物质在其结构中有几个基本部分，但使用含有三乙胺的流动相作为添加剂时，基于胸腺嘧啶和胞嘧啶的磷酰胺没有观察到拖尾现象。所有化合物都获得了良好的分辨率。


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