增强型绿色荧光蛋白mRNA偶联的RP和IEX分析

寡核苷酸在基因检测、研究和法医学中非常重要。一段时间以来，基于寡核苷酸的方法已被开发用于不同的药物应用。为了监测寡核苷酸或蛋白质的时间和维度扩散，可以将其与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）偶联。

增强型绿色荧光蛋白

EGFP的分子量为26.9kDa，是绿色荧光蛋白（GFP）的单点突变，该绿色荧光蛋白最初来源于维多利亚水母。EGFP提高了光谱特性，例如更高的稳定性，主消光从395nm转移到488nm，而主发射保持在507nm，这使得EGFP更适合于现有的光谱分析。

金标准：离子对反相

离子对反相液相色谱（IP-RP）仍然是寡核苷酸表征的金标准方法。当然，寡核苷酸富含电子的主干以及不锈钢柱和管道的典型使用可能会导致不可逆吸附。这是由于离子与组件表面带正电的金属氧化物层的相互作用。

当在低至中性pH值下工作时，这种影响甚至更为关键，因为金属在这些条件下的电正性更强。为了克服这些挑战，可以使用生物惰性系统和色谱柱，例如最近引入的YMC-Accura-Triart色谱柱。YMC-Accura-Triart色谱柱的所有表面（包括熔块）都有生物惰性涂层，以防止任何不必要的离子相互作用。

生物惰性宽孔柱是这里的理想选择

这个申请说明显示EGFP mRNA（996 nt）的分析。通常使用C18修饰的寡核苷酸柱进行分析。然而，由于其高分子量和伴随的高疏水性，短链宽孔柱（如C4）更适合于此类分析。使用 生物惰性YMC-Acura Triart Bio C4PH 7和80°C温度为300Å的温度。

替代方法：阴离子交换色谱法

除了基于RP的方法外，离子交换（IEX）方法也可以提供一种替代方法。强阴离子交换器 BioPro IEX QF公司以季胺类残基为官能团。这种无孔柱在与分析物分子量无关的低操作压力下提供了高效率、极高的分辨率。应用说明还显示了使用BioPro IEX QF柱对EGFP mRNA（996 nt）进行的IEX分离。使用氯化钠和相对温和的温度施加盐梯度，在10分钟内可获得异常尖锐的峰值。