非转基因调控最新ACS NANO:将核酸/肽复合物喷洒到植物细胞核和叶绿体中进行非转基因调控

研究背景

使用传统的转基因方法对作物进行工业规模的品质性状改良众所周知是不经济的，因为高昂的生产成本，包括植物再生的繁衍过程和随后的一个优良品系的繁殖。转基因作物也引发了公众对人类、动物和环境的生物安全问题的担忧。因此，通过叶面喷洒生物活性分子的高通量应用可以代表一种优越的作物改良技术。这种技术可以快速、简单地将有用的生物分子导入植物细胞，而无需昂贵、费力的生物分子转移技术。例如，裸双链DNA片段和干扰性小的RNA（siRNA）的叶面应用能够在不永久改变植物基因组的情况下，对植物的代谢特性和经济重要特性进行工程化。

基于纳米载体的分子递送是一种有前途的植物改良技术。各种金属、非金属和聚合物基纳米载体已与生物活性分子结合，这些生物分子/纳米载体复合材料已通过植物细胞壁网络到细胞质。最近的研究表明，在叶面喷洒后，生物分子/纳米载体偶联物可以通过叶表皮或气孔途径转移到植物细胞中。纳米载体还被用于保护这些生物分子免受植物细胞中各种降解过程的影响。这些研究强调了纳米载体在系统改善经济作物质量性状方面的潜在用途。

在纳米载体中，基于多肽的载体不仅可以将感兴趣的生物分子转移到刚性的植物细胞边界上，还可以将生物分子转运到细胞中的特定细胞器。细胞穿透肽(CPP)是一种短链氨基酸，可以自发渗入植物细胞壁和质膜。阳离子CPP，如KH9和R9将生物分子被动转移到植物细胞中。两亲性CPP BP100及其阳离子衍生物具有更强地结合各种生物分子并将其输送到不同植物细胞中的能力。细胞器靶向肽(OTP)是将生物分子转运到特定细胞器的功能性肽。OTP，例如线粒体靶向肽(MTP)和叶绿体靶向肽(CTP)，通常来源于细胞核编码的细胞器蛋白的细胞器靶向结构域。MTP和CTP识别特定的细胞器膜部分或选择的转运蛋白，并将相关的生物分子转移到目标细胞器中。

工程化CPP和OTP通过其相应的氨基酸残基结合不同的生物分子。DNA和 RNA 分子通过非共价的正负电荷相互作用自发地与多肽中带正电荷的氨基酸侧链结合，并产生亚微米大小的肽/核酸复合物。用基因表达盒/CPP复合物转染的植物细胞显示出DNA分子有效易位到细胞核以及外源基因的瞬时表达。被双链GFP干扰RNA/CPP复合物浸润的转基因GFP过表达植物表现出较低的GFP转录物水平高于野生型，同时GFP积累减少。此外，功能性蛋白质通过功能化的CPP成功地内化到植物细胞中。

细胞器转化的最新进展涉及使用纳米载体将感兴趣的生物分子精确地运输到所需的植物细胞器中。基于OTP的纳米载体已成功用于将生物分子转运到植物线粒体和叶绿体中。此外，质粒DNA/OTP复合物与CPP的表面修饰显著增强了重组蛋白在线粒体和各种类型的质体（包括叶绿体）中的表达。这些功能化CPP和OTP的使用突出了基于肽的植物生物分子递送系统的先进开发。阳离子CPP和OTP的各种组合已成功用于使用注射器浸润、真空/压缩浸润或注射将含有报告基因表达盒的质粒DNA递送至植物细胞中的细胞核和靶向细胞器。然而，这些技术对于在农业条件下重新编程植物品质性状是不切实际的。因此，显然需要一种高效、高通量、低成本的生物分子递送技术。

在目前的研究中，为了开发一个将基于肽的生物分子递送到植物中的大规模平台，作者设计了一种叶面喷洒技术，将核酸/肽纳米载体引入植物细胞的胞质溶胶、细胞核和叶绿体中。作者评估了天然衍生和人工合成的 CPP 通过喷雾应用渗透细胞的能力。影响喷雾效率的因素包括缓冲系统、保卫细胞密度和叶毛密度。叶面喷洒基于CPP的质粒DNA(pDNA)或siRNA复合物显著提高了核酸递送到植物细胞中的效率。有趣的是，siRNA分子成功地靶向叶绿体，通过可喷涂的簇状CTP/CPP纳米载体介导的过程抑制叶绿体表达蛋白质的功能。我们基于肽的核酸喷涂平台能够对农业条件下栽培作物的商业重要特征和代谢特征进行高效、全面的工程设计。

文章亮点

1. 作者提出了一个用于植物的高通量核酸递送平台，该平台通过喷雾施加到叶表面的肽纳米载体。

2. 喷雾时亚微米级核酸/肽复合物的易位取决于肽的物理化学特性，并受植物细胞中气孔依赖性摄取机制的控制。

3. 使用基于细胞穿透肽(CPP)的叶面喷洒将DNA分子有效递送到植物中。

4. 使用叶面喷洒，通过siRNA-CPP复合物在植物核中引入干扰性小RNA分子，更重要的是，通过CPP/叶绿体靶向肽介导的递送系统在叶绿体中成功地进行基因沉默。

5. 这项技术可以对农业系统中具有重要经济意义的植物性状进行有效的非转基因工程。

图文速读

图 1. 喷洒后CPP在叶片中的细胞穿透和转运。

(a)叶细胞结构和喷洒后CPP进入不同叶细胞层的可能吸收机制；(b-e)不同四甲基罗丹明(TAMRA)标记的CPP在喷洒后的不同时间保留和易位到拟南芥叶子的上表皮细胞；

(b, c)和栅栏叶肉细胞；

(d, e)中对每个TAMRA-CPP进行了两个独立的实验（每个实验两片叶子），并且通过CLSM观察了一片叶子中的两个感兴趣区域（ROI）。

喷洒后不同时间点叶片中8个ROI(n = 8)的平均荧光强度显示为上表皮细胞(b)和栅栏叶肉细胞(d)的热图。TAMRA 荧光信号在植物细胞中的分布如图S2所示。彩色条表示热图中的荧光强度范围，以任意单位(A.U.)为单位。

(c, e) 比例尺 = 50 μm；

(f)三种商业上重要的大豆品种（5 周龄）的植物特性，比例尺 = 15厘米；

(g)喷洒TAMRA标记的CPP后不同时间点大豆叶片表皮细胞的 TAMRA 荧光强度，植物细胞中TAMRA荧光的分布以箱形图的形式呈现，来自8个不同的感兴趣区域（每片叶子2个ROI，每个实验2片叶子，2 个独立实验，n = 8）；黑条显示中值。

图 2. 喷洒后将质粒 DNA/CPP 复合物转染到植物细胞中。

(a)将不同 Cy3 标记的pBI221/CPP复合物喷洒到植物上进行转染分析。

使用五种不同的BP100衍生的CPP形成Cy3-pBI221/CPP复合物并喷洒到叶子上。CLSM在喷雾后2小时观察到转染细胞中的Cy3荧光信号；

(b) 用不同的Cy3-pBI221/CPP复合物喷洒后2小时，过表达YFP的转基因拟南芥叶细胞中Cy3的荧光强度。

Cy3信号在20个CLSM图像中的分布，该图像是从每个处理的四个实验独立叶子（每片叶子5个ROI，每个实验一个叶子）收集的，显示为箱线图。黑条表示分布的中位数。每个数据点由一个洋红色点表示；

(c-h)在喷洒后2小时喷洒不同的Cy3-pBI221/CPP复合物后，过表达YFP的拟南芥叶细胞（黄色）中Cy3-pBI221（青色）的内化。比例尺 = 5 μm。

白色箭头表示(i-l)中所示的Cy3和YFP荧光曲线的检测轨迹；

(m)喷洒不同Cy3pBI221/CPP复合物后大豆叶细胞中Cy3荧光的箱形图（n=来自三个独立实验的12个ROI，每个实验每片叶子4个 ROI）；

(n)用Cy3-pBI221/CPP复合物喷洒后过度表达GFP的转基因番茄叶细胞中Cy3荧光的箱线图（n=从三个独立的叶子收集的15个ROI，每个实验每叶5个ROI）。

箱形图中的不同字母表示通过单因素方差分析和Tukey的HSD检验在p = 0.05时分析的六种处理之间均值的显著差异。

图 3. 叶面施用后，基于细胞穿透肽的DNA货物进入植物细胞的吸收效率。

(a)将质粒DNA(pDNA)叶面施用到由细胞穿透肽(CPP; KH9-BP100)介导的拟南芥叶细胞中，pBI221/KH9-BP100复合物在水溶液中形成并使用喷雾雾化器施用于叶子；

(b)喷洒含有pDNA/CPP复合物的溶液后24小时叶片中的GUS活性，至少20片喷洒过的叶子中GUS活性的分布显示为箱线图；

(c)喷有pDNA/CPP复合物溶液的叶片中GUS报告基因的组织化学染色；

(d，e)通过喷雾转染pDNA/CPP复合物的大豆（大豆）叶片中GUS报告基因的GUS活性和组织学染色，面板e中的比例尺为500 μm，GUS活性在至少16片喷雾叶片中的分布显示为箱线图，点代表单个数据点。

不同的字母表示GUS活性的显著差异，通过单因素方差分析和Tukey的HSD检验在p = 0.05处进行分析。

图 4. 可喷涂肽基siRNA货物介导的植物细胞基因表达抑制。

(a)用于转基因拟南芥叶中YFP转基因抑制的siGFPS1/KH9-BP100复合物的配方；

(b)用含有siGFPS1/KH9-BP100复合物的溶液喷洒(3DAS)后3天，植物细胞中的YFP荧光，比例尺=50 μm；

(c)在3DAS与siRNA/CPP 复合物的植物细胞中YFP的定量荧光强度，来自15个ROI的YFP荧光分布（n = 15，从一片叶子收集5个 ROI，3个生物独立实验）显示为箱线图，点代表荧光值，黑条显示中值；

(d)用siRNA/CPP复合物在3DAS从拟南芥叶子中提取的可溶性蛋白中的YFP和内源性RubisCo激活酶1蛋白（RCA1；一种高度丰富的细胞内植物蛋白）的免疫印迹分析，在用抗体探测之前，将膜用 Ponceau S染色，RbcL = RubisCo大亚基；

(e)通过免疫印迹测定的siRNA/CPP复合物在3 DAS总叶蛋白中YFP/RCA1的相对丰度，相对于RCA1的YFP量显示为箱线图，洋红色圆圈代表数据的分布(n = 5)，黑条显示中值；

(f)具有siRNA/CPP复合物的3 DAS叶片中的相对YFP转录水平，洋红色点代表五个不同实验（n = 5）中的相对YFP转录水平，箱形图中的不同字母表示显著差异，通过单因素方差分析和Tukey的HSD检验在p= 0.05处进行分析。

图 5. 喷洒siRNA/CPP复合物介导的番茄叶片转基因抑制。

(a)在喷洒后3天用siGFPS1/KH9-BP100复合物喷洒后，过表达GFP的转基因番茄叶片表皮细胞的CLSM图像(DAS)，比例尺 = 20μm；

(b)在3 DAS喷洒siRNA/CPP复合物的叶片中GFP荧光强度的分布，通过ImageJ从CLSM图像分析的GFP fl荧光的数据点(洋红色圆)以箱形图显示(n = 30 roi，每片叶子10 roi，三个独立实验)，黑条代表中值；

(c)在仅喷洒KH9-BP100 (P)、仅siGFPS1(S)和以N/P比= 2.0形成的siGFPS1/KH9-BP100复合物的番茄叶片中GFP和RCA1 (内源植物蛋白对照)的免疫印迹分析(C)，膜被Ponceau S (Pon S) 染色以确认蛋白质负载相等，如膜上的RbcL带所示；

(d) 喷洒siRNA/CPP复合物的转基因番茄叶片中GFP积累的定量分析，通过ImageJ从三个实验独立的免疫印迹膜中分析了相对GFP/ RCA1蛋白水平，误差线=标准偏差(SD)；

(e)喷洒siRNA/CPP复合物后叶片中的转录抑制，通过qRT-PCR在3 DAS处分析了三个独立番茄叶片中的GFP转录水平，误差线=SD，图中的b、d和e中的处理之间的显著差异由图中的不同字母表示，通过单因素方差分析和Tukey的HSD检验在p = 0.05。

图 6. 通过基于肽的叶面喷洒将质粒DNA和siRNA分子靶向递送到叶绿体中。

(a)形成聚集的生物分子/叶绿体靶向肽/细胞穿透肽复合物，用于将生物大分子靶向递送至植物细胞中的质体；

(b)在喷雾后的不同时间，在N/P比 = 1.0形成的簇状pPpsbA:Rluc/肽复合物喷洒的拟南芥叶片中的海肾荧光素酶活性，植物细胞中荧光素酶活性的分布显示为箱线图，点代表每次处理8个不同样品中荧光素酶活性的分布（n = 8），黑条是分布数据的中位数，NT=未转化的叶子；

(c)用不同N/P比率形成的siGFPS1/肽复合物喷洒3天后，转质体eGFP过表达烟草叶细胞的叶绿体中的GFP荧光，表皮细胞叶绿体中的GFP荧光通常比叶肉强（另见图 S25）比例尺=20 μm；

(d)在3 DAS喷洒siRNA/肽复合物的植物细胞中，标准化的GFP/叶绿素荧光，植物细胞中fl荧光值的分布以箱形图显示，点表示每次处理(n = 16)的16个不同样品中的fl荧光值的分布，NT=未转化的叶子，P=用当量摩尔的肽喷洒的叶子，用于以N/P比=5.0形成siRNA/CTP/CPP复合物，S=siGFPS1仅喷洒的叶子；

(e)喷洒siRNA/肽复合物的转质烟叶总叶蛋白的免疫印迹分析，在用抗RubisCo活化酶1(α ra 1)和抗GFP抗体探测之前，用Ponceau S染色溶液对膜进行染色，以确认蛋白质负载相等(由膜上的RbcL条带指示)；

(f) 三种实验独立的siRNA/肽复合物喷洒叶片中的GFP/RCA1定量水平，通过ImageJ从免疫印迹膜上的相应蛋白质带计算相对GFP/RCA1水平，误差条 = SD (n = 3)；

(g)在3 DAS处，siRNA/肽复合物喷洒的植物叶片叶绿体中eGFP转录本的表达降低，通过qRT-PCR检测植物叶片中fegfp基因的转录变化(n = 3)，误差条 = SD，箱形图和条形图中的字母显示了在p=0.05时通过单因素方差分析和Tukey的HSD检验分析的差异的统计意义。

总结展望

作者证明了生物活性分子可以使用基于肽的喷雾成功地应用于植物，而无需昂贵的设备和繁琐的制备程序。 叶面喷洒后，亚微米大小的核酸/肽复合物通过保卫细胞转移到植物细胞中。基于可喷雾肽纳米载体的 DNA 递送平台对不同的植物物种（包括农作物）有效。此外，使用我们基于靶向肽的生物分子喷雾应用系统成功地将 siRNA 分子转运到植物细胞中，以特异性诱导叶绿体中的基因沉默。我们的高通量基于肽的核酸喷雾技术能够在不引入转基因的情况下，在农业条件下对植物经济上重要的性状和代谢过程进行综合工程。