与反相色谱法相比，亲水作用色谱法（HILIC）分离模式为碱性肽的分析提供了许多优势，例如良好的峰形状和分离效率。然而，样品溶剂与高有机流动相匹配的需要限制了HILIC的使用。本文探讨了柱开关方法的适用性，以使HILIC能够用于大注入量的水样。


介绍

活性药物成分的效力和纯度的测定在药物开发的许多阶段都很重要，例如用于确定保质期的制剂开发和稳定性研究。反相液相色谱（RPLC）通常用于这类测定。RPLC对于小分子和生物分子来说都是一种坚固且成熟的技术。然而，由于与分析物的不必要的硅醇相互作用，基本分子（如含有氨基酸赖氨酸或精氨酸的肽）很难通过RPLC进行分析，这可能导致峰拖尾和峰加宽[1]。

离子对试剂（如TFA）或流动相中的大量盐可以减少这种不必要的相互作用，但另一方面，如果使用MS检测，则可能会导致问题。TFA会导致离子抑制[2]，从而降低MS响应，非挥发性缓冲盐直接不适合与MS结合使用。

根据我们的经验，HILIC对于碱性肽来说是一种很有吸引力的技术，因为它提供了与MS兼容的流动相的良好峰形状。

一般认为，HILIC中的保留主要是由于分析物在流动相和亲水柱表面附近的富水溶剂层之间的分配[3,4]。这一机制可以解释HILIC中二次相互作用减少的原因，因为分析物与柱材料本身没有相互作用，或者至少与RPLC相比没有相互作用。

限制HILIC使用的是需要将样品溶剂与高有机流动相匹配。由于水是HILIC中的强溶剂，注射水溶液将导致注射时分析物的部分洗脱。这称为样品溶剂效应，它会导致峰值畸变、保留率和效率损失[5]。因此，配制成水溶液的肽不适合HILIC直接分析。

本文提出了一种全自动的方法，通过使用柱开关方法消除HILIC中大量水性肽样品的样品溶剂效应。


实验（HILIC方法）

乙腈（JT-Baker，超梯度级）用作HILIC流动相A。将7.7 g醋酸铵（Merck，p.A.）和2000µl冰醋酸（Merck）添加到1000 ml水中（测量pH 5.1），制备HILIC移动相B。捕获流动相为水中5%的乙腈。

[Lys8]血管加压素和[Arg8]血管升压素作为冻干粉末从Sigma-Aldrich购买，溶解在流动相B中，并混合以含有20µg/ml的每种成分。

实验在安捷伦1260高效液相色谱仪上进行，配有紫外线检测器、两个泵和一个六端口双位置切换阀，仪器配置见图1。捕集柱为2.1x10 mm XTerra MS C18预柱（Waters）。HILIC柱为Accucore HILIC，3.0 x 150 mm，2.6µm（Thermo Fischer Scientific）。柱温为60℃，检测波长为277nm。注射体积为100µl。

HILIC梯度如表1所示。捕获流动相的流量为1.0 ml/min。


为了进行比较，也在不使用柱切换的情况下注射混合加压素样品，即直接在HILIC柱上注射水溶液。所有其他方法参数保持不变。


实验（反相法）

反相实验中使用了与HILIC实验中相同的流动相、样品和设备。断开色谱柱开关，样品直接注入色谱柱。反相柱为Kinetex C18，3.0 x 150 mm，2.6µm（Phenomenex）。除梯度和流量外，所有仪器设置均与HILIC运行相同，见表2。


反相法未对血管加压素进行优化，仅在峰不对称性和峰宽方面与HILIC进行比较，流动相类似。

结果和讨论

HILIC和反相色谱图分别如图2和图3所示，峰值数据比较如表3和表4所示。结果表明，HILIC在峰宽、不对称性和分辨率方面优于反相色谱法。在HILIC中，正电荷肽以高斯峰的形式洗脱，不对称因子为1.0，同时使用MS-友好流动相。在反相色谱中，相同的肽与反相键合二氧化硅的带负电荷的残留硅醇基团相互作用，显示出高度的拖尾和峰展宽。增加的尾矿和峰加宽降低了峰容量和分离密切相关杂质的可能性，HILIC和RPLC的分辨率分别从9.5降低到1.5。可以注意到，由于柱极性相反，HILIC中两种加压素的洗脱顺序与反相相反。



图2比较了将水样注入HILIC（安装和未安装柱开关）后的色谱图。结果说明了将水溶液直接注入HILIC柱的问题。当直接注入色谱柱时，样品溶剂效应会导致严重的峰分裂和峰展宽。然而，当使用柱切换方法时，样品溶剂在HILIC柱之前被除去，因此也会产生样品溶剂效应。

该装置具有柱切换和捕集柱，其工作原理类似于与HILIC耦合的在线固相萃取方法。理论上，水样品的注入量没有上限，因为样品集中在捕集柱上，样品溶剂被去除。

还应注意的是，在转移到HILIC色谱柱之前，柱切换装置也会对样品进行脱盐，因为样品中的任何缓冲盐都不会被反相捕集色谱柱截留并被丢弃。缓冲盐是HILIC中的一个潜在问题，因为它们通常在大量乙腈中不易溶解，这可能导致沉淀和色谱柱堵塞。

总之，该技术提供了一种全自动的方法，可以消除HILIC分析水溶液时的样品溶剂效应。该原理的潜在扩展建议是测试不同类型的捕集柱与不同的流动相结合，以探索选择性和捕集。


工具书类

1.Snyder LR、Kirkland JJ、Glajch JL。实用HPLC方法开发第2版（2012年），7.3.3.2。硅醇效应

2.Nshanian M、Lakshmanan R、Chen H、Ogorzalek Loo RR、Joseph A.Loo J.使用增压剂提高肽和蛋白质的液相色谱-质谱分析的灵敏度。国际J质谱学。2018年4月；427:157-164.doi:10.1016/j.ijms.2017.12.006。

3.Alpert AJ。用于分离肽、核酸和其他极性化合物的亲水相互作用色谱法，色谱杂志A，第499卷，1990年1月19日，第177-196页。doi.org/10.1016/S0021-9673（00）96972-3

4.Buszewski B，Noga S.亲水作用液相色谱（HILIC）-一种强大的分离技术。《分析与生物分析化学》，2012年1月，第402卷，第1期，第231-247页

5.Keunchkarian S，Reta M，Romero L，Castells C.样品溶剂对反相液相色谱条件下洗脱的分析物色谱峰形状的影响，色谱杂志A，第1119卷，第1-2期，2006年6月30日，第20-28页


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