利用离子色谱-质谱法分析一种小分子有机酸的杂质

小型有机酸在整个制药行业中都有使用[1]，但在使用反相高效液相色谱（HPLC）和气相色谱（GC）等传统方法时，在分析上具有挑战性。离子色谱（IC）可以更好地对这些酸进行分析分离，但电导检测无法提供峰纯度信息。当与质谱（MS）联用时，可获得有关各峰成分的信息。IC-MS用于2-丁酸杂质分析方法的建立；可以分析杂质并确认其峰值纯度。评估了一系列有机酸的灵敏度和线性方法的定量性能，这些有机酸以代表杂质的水平加入2-丁酸中[2]。

介绍

有机酸在药物合成过程中用作试剂或可能形成杂质。它们需要在整个合成和制造过程中得到控制，以确保最终产品的质量。起始材料或中间材料中存在的微量杂质如果未被检测到，会直接影响最终产品的质量。在后期发现产品质量的差异，使得在生产过程的前几个不同阶段识别污染物在技术上具有挑战性且成本高昂。原料和中间体越纯净，就越容易控制和保证最终产品的质量。因此，准确可靠的有机酸杂质分析检测对于生产内部使用产品的人员来说是一项极其重要的要求。在投资于昂贵的原料或中间体供应时，必须有能够识别和量化所有可能杂质的方法。

广泛使用的分析方法，气相色谱（GC）和高效液相色谱（HPLC），在应用于有机酸分析时面临众多挑战[3,4]：

•小有机酸（其中许多是高度极性分子）很难保留在反相LC柱上。

•由于它们通常是较差的生色团，使用UV检测分析小型有机酸可能会产生不同的响应因子和较差的灵敏度，因此无法用于准确定量，尤其是在较低水平下。

•使用低波长检测进行测量也对用作洗脱液成分的溶剂或添加剂的类型造成了一些限制，进一步限制了LC分析的范围。

•对于使用GC分析的样品，通常需要对其进行衍生，增加了额外的样品处理水平[5,6]，从而使协议更加耗时。

另一方面，具有抑制电导检测（sCD）的离子色谱（IC）是一种在不衍生的情况下分析有机酸的很有前途的方法。当与MS结合时，它提供了更好的灵敏度和更高的潜在分析物分辨率[7,8]，从而能够准确定量解析的峰并提高质量保证。离子色谱法利用了这样一个事实，即有机酸很容易通过向洗脱液中添加碱性添加剂而带电。酸类的分离是通过带负电荷的酸性基团与柱上的铵树脂用碱性洗脱液进行离子交换来实现的[9]。

IC天生更适合分析极性分子：分离高度依赖于分析物的pKa和粒荷比。然而，带有电导率检测的IC分析并不能对每个峰对应的成分进行绝对识别，反过来，如果存在部分或完全共稀释的所有痕量杂质，则无法准确定量。因此，由于仅使用IC-sCD无法直接跟踪峰纯度，因此阻碍了识别未知物的峰确认。因此，尽管IC方法很有前景，但在有机酸分析中却未得到充分利用。

提高整体选择性的一种方法是将IC与MS耦合。每个峰获得的质量信息允许相应组分的另一级分辨率，从而提高分析方法的特异性和选择性。然而，IC阴离子分析中使用的洗脱液的强碱性与电喷雾电离（ESI）MS不兼容，因为它们可能对MS离子源的不锈钢成分产生腐蚀作用，这又增加了一个需要克服的挑战。最近，洗脱液抑制器使MS耦合更容易[9,10]，因为它们通过在将反离子作为水引入MS离子源之前移除反离子来抑制洗脱液，从而使分析物发生电离。

联用IC和MS以及洗脱液抑制物可以解决峰纯度缺乏可获得信息的问题。这种用于分析极性有机酸的IC-MS方法，在适当开发和优化后，在灵敏度和稳健性方面可作为HPLC和GC方法的最佳替代方法。除了敏感的测量之外，不同行业的质量控制和质量保证实验室还需要可靠且可重复的方法，在所需的动态范围内具有定量能力，以定期检测有机酸杂质，从而提前将风险降至最低。

在这里，我们开发了一种2-丁酸纯度分析方法，以及微量杂质鉴定，以促进制药行业的成功合成过程。含有弱发色团的2-丁酸在HPLC-UV分析测量中通常产生较差的灵敏度，这使其成为验证IC-MS稳健性的良好候选。在该方法中，阴离子分离与ESI-MS结合使用负离子来分析2-丁酸样品中的杂质。评估了IC-sCD和MS检测的定量限和线性。然后使用所开发的方法研究一系列可能作为药物相关水平的杂质存在的有机酸。

材料和方法

标准、材料和仪器

2-丁酸和其他有机酸（即乙酸、丙酸、甲酸、丁酸、巴豆酸、戊酸、丙酸和戊烯酸）的标准品来自Sigma-Aldrich Company Ltd（英国吉林厄姆）。使用从MilliQ装置（赫特福德郡沃特福德）获得的18.2MΩ-cm超纯水稀释样品。HPLC级0.25 M氨和0.25 M醋酸铵来自Fisher Scientific（英国拉夫堡）。2-丁酸的样品来自FAR Chemical（美国佛罗里达州）、Boropharm（美国密歇根州）和AstraZeneca（英国Macclesfield）。

IC-MS在Thermo Scientific Dionex Integrion高压离子色谱仪（英国Hemel Hempstead）和ISQ EC质谱仪（英国Thermo Fisher Scientistic）上进行。IC-MS工作流的设置如图1所示。

IC条件

IC系统包括一个保护柱（Dionex IonPac™ AG11-HC-4μm 2×50 mm），IC柱（Dionex IonPac™ AS11-HC-4μm 2×250 mm）和带电导检测器的抑制器（最初是Dionex AERS 500e 2 mm，然后改为Dionex ADRS 600 2 mm）。Dionex AERS 500e抑制器应用直接固定电流抑制氢氧化物转化为水，钾反离子通过交换膜被排出废物。除非另有说明，否则使用51 mA的抑制器电流。Dionex ADRS 600抑制器应用直接固定电压，以提供最合适的电流，以匹配洗脱液的浓度，从而抑制氢氧化物对水的反应。使用4 V电压。流速保持在0.38 mL/min，所有注射使用25μL的注射体积。等高线法和梯度法的规范如下：

•等容法：30 mM KOH，30°C，低电流29 mA

•梯度法：初始1 mM KOH 8.5分钟，然后在10分钟内线性梯度至15 mM，再过10分钟至30 mM，然后在1.5分钟内达到54 mM。

MS条件

所有MS实验都是在以下条件下进行的：蒸发器温度450°C，离子转移管温度200°C，电离电压-2500 V，护套气体压力50 psi，辅助气体压力5 psi。系统在负离子ESI模式下进行所有分析。MS系统在全扫描模式下运行时，记录了m/z 40-250质量范围的数据。选择离子监测（SIM）模式用于分析脱质子分子。对于全扫描和SIM分析，MS离子源电压（用于帮助去溶剂化）设置为5 V。1:1乙腈的补给流量：以0.1 mL/min的速率添加水（缓冲添加剂，如果使用）。

标准和样品制备

以10 ppm（v/v）或10 mg/L的速度制备单独的有机酸储备标准溶液，但以50 ppm（v/v）或50 mg/L速度制备的丁酸、巴豆酸和戊烯酸溶液除外。通过将储备溶液分别稀释10倍和100倍（50 ppm储备为50倍和500倍），制备1 ppm和100 ppb的混合工作储备溶液。然后稀释这些工作储备溶液，以制备1 ppb至500 ppb之间的一系列校准标准。1 ppm工作溶液用于制备500 ppb、200 ppb和100 ppb标准，100 ppb工作溶液用于制作50 ppb、10 ppb、5 ppb和1 ppb标准。

结果和讨论

向补给流中添加氨气提供了最强的m/z响应

使用等容法分析的2-丁酸的主要杂质产生了m/z 127的离子，部分共洗脱杂质在m/z 171，如萃取离子色谱图所示（图2A）。在补给流中使用不同的添加剂会产生不同的MS信号响应，如图2所示。根据其化学成分，每种添加剂（MeCN:H2O、MeCN:H_2O_2 12.5 mM醋酸铵和MeCN:H _2O_2 25 mM氨）都有助于使溶液中的分析物挥发，进而提高电离过程的效率。在这些添加剂中，在补充溶剂中使用25mM氨对m/z 127和m/z 171离子的响应更大（图2）。因此，在随后的所有实验中都选择了氨。正如预期的那样，梯度法提供了更好的峰分离，从而提供了比等度法更高的组分分辨率。m/z 127和m/z 171的IC-sCD色谱图和提取离子色谱图如图3所示。

柱温对峰形状和分辨率的影响

使用梯度法，研究了一系列可能作为2-丁酸中杂质存在的低分子量有机标准物的分离。以前曾报道过IC中柱的温度会影响离子交换色谱中的峰形状。在此，在30、40、50和60°C的柱温下分析有机酸标准。获得的IC-sCD色谱图对应于不同的色谱柱温度，如图4所示。提高柱温可以改善峰的形状，减少峰拖尾，但会导致早期洗脱峰的分辨率降低。

MS检测提供了比CD更高的选择性

使用梯度法分析浓度在1 ppb至500 ppb之间的有机酸标准，并通过计算R2值评估线性。表1显示了按照洗脱顺序使用IC-sCD和IC-MS测定的每个有机酸成分的定量限（LOQ）和线性。大多数酸在1至500 ppb浓度范围内的R2值在IC-sCD中大于0.99，在MS中大于0.95。采用甲酸和丙酸的MS方法，在评估线性时，通过删除最高浓度标准，R2可以增加到0.99，但这意味着该方法的线性仅在较低浓度范围内更好。

每个成分的1 ppb标准物都很容易检测到，信噪比至少为4:1，这表明LOQ小于1 ppb，而戊烯酸的LOQ为5 ppb。如图5所示，MS响应的信噪比大于IC-sCD响应，并且与IC-sCD色谱中观察到的基线没有问题。在使用该方法的混合溶液中，由于部分共洗脱，无法通过IC-sCD对丙酸和丁酸进行线性或LOQ分析。然而，这些紧密洗脱的分析物的质量不同，因此可以使用MS检测获得分辨率，结果LOQ为1 ppb，如图5中的提取离子色谱（EIC）所示。IC后MS检测的额外选择性允许快速分析有机酸中的峰纯度，并为仅被IC部分分离的杂质提供定量。杂质检测灵敏度的提高使得在生产过程的早期阶段可以更准确地评估已知和未知杂质，从而降低了在后期阶段进行昂贵故障排除的风险。

混合有机酸的MS和sCD检测均达到线性，LOQ低于最低要求阈值

在获得所有低浓度有机酸标准品的成功线性和LOQ后，有必要确认在2-丁酸样品基质存在的情况下是否可以实现这些杂质的线性和LOQ。表2显示了在25 mg/L 2-丁酸存在下使用IC-sCD和IC-MS的每个单独有机酸组分的LOQ和线性值。即使在存在2-丁酸基质的情况下，反应也保持线性。使用IC-sCD获得的定量限低于国际人类使用药物技术要求协调理事会（ICH）[11]建议的杂质定量和识别阈值，因此该技术适用于所有完全溶解杂质的常规分析。MS具有更低的检测水平和更好的灵敏度，可用于痕量分析。

通过电导率和MS检测2-丁酸样品中所有有机酸的IC结果的相对标准偏差显示出良好的再现性

制药行业的杂质检测需要可靠且可重复。通过10次注射50 ppb混合有机酸样品和0.25 mg/L 2-丁酸中0.1%（w/w）杂质级有机酸混合物，评估IC-MS响应的再现性。根据十次注射获得的峰面积值计算相对标准偏差（RSD）。使用IC-sCD，除戊烯酸外，所有组分的峰面积RSD均小于2%，表明具有良好的重现性。MS检测产生两种样品类型的峰面积RSD在4-10%范围内（表3）。MS响应可变性是潜在电离过程的直接结果，但在痕量分析的可接受RSD范围内。这些结果表明，即使对质谱条件进行了很少的优化，IC-MS在常规和痕量分析的所有组分中都是可重复的。

结论

通过将IC与MS耦合，可以在不衍生的情况下准确定量小有机酸（如2-丁酸）的杂质，但有利于质谱数据的绝对鉴别。由于线性、定量限和重复性测量在药学上可接受的范围内，该方法现在可用于杂质的常规分析（在适当的方法开发后使用IC-sCD）或痕量分析（使用IC-MS进行成分鉴定）。正如预期的那样，补充溶剂的添加剂选择是IC-MS方法中的一个关键变量，直接影响MS响应。优化柱温可以改善峰形状。

MS提供的额外选择性允许峰值纯度跟踪测量，否则仅对IC-sCD具有挑战性。例如，共洗脱分析物2-丁酸和丙酸在等度或梯度IC方法中无法解析，但可以使用提取离子色谱图轻松检测、解析和量化。当面对共洗脱杂质时，使用测量其质量提供的信息并提取相应的离子色谱图，而不是依赖其洗脱曲线获得的信息，可以解决这些杂质，即使这在色谱上是不可能的。因此，当定量紧密洗脱或重叠杂质时，质谱联用变得尤为重要。

无需衍生化，IC-MS更直接、更快地执行，节省了方法开发和后续常规分析的宝贵时间。它比反相高效液相色谱法和气相色谱法具有优势，可对极性有机酸杂质进行灵敏和可重复的测量，也可用于研究其他极性离子分析物，如胺和草甘膦[12]。