环保型反相高效液相色谱法——用异丙醇取代乙腈，用于核壳色谱法的分析和纯化

诺华是环境可持续性的领导者，其战略目标是减少整个组织的废物流。在Global Discovery Chemistry中，许多化学家仍然主要使用乙腈（ACN）作为反相色谱的首选溶剂，尽管这是一种有效的策略，但它对环境有毒。在药物化学中实施绿色化学实践已被证明具有环境、安全和成本效益。考虑到环境可持续性是一个商业目标，诺华已开始挑战化学家在反相色谱法中使用ACN的“舒适区”，并尝试用更环保的溶剂异丙醇（IPA）替代。这是一个相当大的挑战，因为需要调整分析和制备应用中的方法，同时考虑到使用IPA时的技术问题。本文概述了如何利用创新的核壳分析柱和制备柱克服这些挑战。此外，充分强调了这些方法的正交性，并举例说明了只有使用RP-IPA才能成功进行的纯化。当使用IPA时，这种“正交性”是一个令人惊讶的优势，因此实施了一个强大的净化流程来利用它。

介绍

几年来，药物化学领域一直在朝着更可持续的化学合成工艺设计方向发展。GSK在这一领域开展了开创性的工作，在那里他们描述了适合药物化学和分析实验室的定制溶剂选择指南[1]。最近，公司间合作发布了一份关于分离溶剂“绿色”评分评估的报告[2]。在色谱应用中替换更多有毒溶剂的项目是一个热门话题，该项目始于在正相应用中替换二氯甲烷（DCM）的想法[3,4]。诺华公司持续的可持续发展目标以及将实验室实践转变为更“绿色”的组织，引发了在色谱应用中用IPA取代ACN的愿望。诺华公司已经对超临界流体色谱法（SFC）进行了大量投资，将其作为许多正相手性和非手性色谱应用的“绿色”替代品，并且这种转变已被证明是减少有毒正相溶剂（例如庚烷和DCM）的成功策略[5,6,7]。在诺华生物医学研究院（NIBR），大部分化合物通过开放存取色谱分析方法进行分析，以评估反应优化和最终纯度。这些方法也被用作LC纯化和RP Flash纯化的“侦察准备”[8]。由于这种策略，反相高效液相色谱法（HPLC）已被引入相当数量的净化仪器中。IPA等绿色溶剂是从农作物加工中提取的环境友好溶剂或生物溶剂，而ACN主要作为丙烯腈制造的副产品生产[9]。ACN的使用在制药工业色谱应用中被广泛接受，尽管它被认为是不可取的且不是绿色溶剂[1]。由于IPA具有良好的环境可持续性得分[1]，因此研究IPA作为RP色谱的新溶剂是一个自然的步骤。化学家要接受这一新的色谱分析方法还有许多挑战要克服，本文描述了这是如何在逐步过程中实现的。

仪表

开放存取分析RP-ACN方法

反相UHPLC-MS分析

Waters Acquity UHPLC二进制系统，PDA

探测器，

SQ质量规范

色谱柱：Waters Acquity BEH C18 1.7μm 30 x 2.1 mm

柱温：40ºC

流速：1 mL/min

开放存取分析RP-IPA方法

反相UHPLC-MS分析

Waters Acquity UHPLC二进制系统，PDA

探测器，SQ质量规范

柱：Waters Cortecs C18 2.7μm 50 x 2.1毫米

柱温：80ºC

流速：1 mL/min

RP-ACN制备方法

反相UHPLC-MS分析

Waters Autolynx LC-MS公司

探测器，SQ质量规范

色谱柱：Waters Acquity BEH C18 5μm 100 x 50 mm

柱温：50ºC

流速：140 mL/min

RP-IPA制备方法

反相UHPLC-MS分析

Waters Autolynx LC-MS公司

探测器，SQ质量规范

柱：Waters Cortecs C18 2.7μm 50 x 50 mm

柱温：50ºC

流速：140 mL/min

IPA引入uPLC OA标准工作流带来的挑战

在正相色谱中，IPA更常用作改性剂，但由于其与水和大量不同溶剂的混溶性，也可用于反相高效液相色谱。IPA的粘度是ACN的6倍，因此对任何色谱应用都是一个挑战，因为它的使用将导致明显更高的背压。抵消这种影响的一种方法是提高色谱柱温度，从而降低粘度和操作压力。在某些情况下，提高温度也可以提高分离效率。

首次对UPLC系统进行了研究，采用标准开放存取（OA）ACN方法，并与用IPA取代ACN的相同方法进行了比较。图1显示了40ºC下BEH C18 2.1x50mm 1.7μm色谱柱上的筛选结果，其中ACN与0.2%甲酸（FA）水的梯度为5-98%，注射量为1 uL，IPA与0.05%FA水和3.75 mM醋酸铵（AA）注射液的梯度为5至98%，在80ºC时的梯度为1μL。

即使将色谱柱加热至80ºC，BEH C18 1.7um色谱柱上的RP-IPA也被认为不是最佳选择，因为我们观察到随着时间的推移背压较高，色谱柱不稳定。虽然观察到色谱法与一些杂质的保留顺序偏移正交，但也观察到纯度差异，如图1所示的典型样品示例。由于RP-IPA提出的技术挑战，我们本可以很容易地取消这些调查，尽管最初的结果令人失望，但我们相信我们可以实现这种溶剂范式的转变。

图1.在BEH C18 1.7μm色谱柱上比较UPLC注射与RP-ACN和RP-IPA。

我们继续研究新的参数，并选择了粒径更大的2.7μm的新型固体核壳柱，以降低1.7μm全多孔颗粒所观察到的背压。这些核壳色谱柱的外部孔隙度要高得多，这样可以加快分析速度，或者使用更长的色谱柱来获得更好的分辨率。UHPL[10]中固体芯粒子的理论和优点所示的示例很好地证明了这种效果。

图2。全多孔颗粒与核壳颗粒的对比图。

在色谱柱温度80ºC、IPA 0.05%FA下，用1μL注射液对Cortecs C18 2.1x50 mm 2.7μm色谱柱进行测试，并与BEH C18 2.1x 50mm 1.7μm、ACN 40ºC和1μL注射剂进行比较。图3清楚地表明，使用IPA可以观察到更好的分离，图4突出显示了一个示例，其中在RP-ACN方法中只观察到一个峰，在RP-IPA中观察到结构异构体的良好分离。

图3。与RP-IPA和RP-ACN的分离比较表明，实心颗粒C18色谱柱具有优越的性能。

图4。用RP-IPA和RP-ACN进行分离的比较，证明了核壳法与IPA的正交性。

经过数千种化合物的测试，IPA被确定为常规OA-UPLC分析评估的替代洗脱剂，因此被引入。因此，一些RP-ACN OA分析方法被取消使用，从而降低了ACN的消耗量。

为IPA重新设计RP准备系统

在OA分析应用中引入IPA作为“绿色溶剂”只是这一故事的一半，当你考虑到在纯化中引入RP-IPA的挑战时，同样是由于高粘度和相关的背压IPA证明了这一点。这些与ACN的差异只会在较高流速下加剧。第一个主要目标是研究反相制备系统接受IPA作为合适溶剂的可行性。由于其粘度高，在室温下运行时系统的背压被认为过高（>5000psi）。由于过压，系统不能接受超过30%的IPA改性剂而不发生故障。我们知道我们面临着一个真正的技术挑战，而用较高的IPA改性剂实现较低背压的唯一方法是加热色谱柱，甚至同时加热色谱柱和溶剂。我们考虑安装柱浴，但在常规净化实验室中，这种解决方案被认为太不切实际，而且可重复的温度调节也可能是一个问题。为了提高柱温，从ABSys（德国）订购了一个“定制”柱烘箱，在那里不仅加热制备柱，还加热溶剂预柱的总流量（图5）。我们还需要将整个制备系统的内管直径从0.01英寸增加到0.02英寸，以减少固有的系统压力，而不会显著影响色谱。此外，我们还对MS裂解系统进行了改造，并减少了死体积，以进一步降低固有的系统背压。

Once the modified reverse phase system was rebuilt, the challenge we observed was in purifying using the exact same stationary phase. At that time Cortecs preparative columns were not commercially available, and we had to initially test the BEH C18 100mm x 50mm purification column. We noticed that we still had to dramatically reduce the %IPA in our focused gradient methods to 5-50% max IPA to make this practically feasible. This was to avoid reaching the maximum pressure of the system of 5000 Psi or 340 bar. We also noted that the loading capacity is affected and we needed to reduce from 200 mg of test mixture per injection to 50 mg (Figure 6). The first acceptable sample was performed on BEH C18 50x100cm 5 um column, in 9 min run time, with a flow rate of 140 mL per minute, at 50ºC and water 0.2% FA as mobile phase additive. Peak shapes for our standard test mixture were much improved in 0.1%TFA gradients compared to 0.2%FA gradients as demonstrated in Figure 6.

图7。使用BEH C18 5um 100x50mm纯化柱与RP-IPA 0.2%FA和0.1%TFA进行分离比较。

我们如何在RP准备中制定IPA标准工作实践

虽然我们看到使用RP-IPA对BEH C18 5μm材料100mm x 50mm进行净化取得了一些成功，但我们感到不舒服，因为无法使用相同的固定相进行有效的“Scout to Prep”方法转移。最后但并非最不重要的目标是为本项目获得代表我们包装的“定制”Cortecs C18色谱柱2.7μm。我们与Waters合作，迅速着手定制Cortecs C18 2.7μm准备柱的任务。与Waters进行了多次讨论后，由于技术原因，无法包装50x100cm Cortecs制备柱，因为这种材料比标准C18多孔材料更难包装。沃特斯提出尝试包装一个50x50cm 2.7μm的Cortecs C18。这里的主要优点是可以加载更多复合，增加流量并减少并行运行时间。

经过优化，现在已经实施了一种方法，每次注射的载药量达到200 mg，在50ºC下，以FA或TFA作为添加剂，运行时间为5分钟，完全达到我们的常规化合物标准量（在RP-ACN等效制备方法中）。多亏了Waters，由于具有聚焦梯度和更短的制备柱长度，我们现在甚至可以减少制备过程中所需的IPA溶剂量。我们还可以增加分离实验室的容量，因此，我们可以为非手性RP色谱实施更环保、更快、更具成本效益的解决方案。图8展示了这方面的一个示例，其中将IPA 3分钟制备梯度与6分钟ACN梯度进行了比较

结论

在反相色谱中实现IPA作为ACN的环保替代溶剂一直是一个重大挑战。我们已经在巴塞尔的全球发现化学会议上证明了这一挑战值得克服，并采取了一些创新措施，通过利用核壳技术实现了强大的OA分析筛选和“侦察到准备”。我们要感谢Waters对本项目的创新和参与，以提供“定制”净化核壳颗粒柱。这种新型制备柱已被证明是从Cortecs RP-IPA OA分析方法中筛选纯化方法的理想选择。我们还希望认可ABSys用于实施净化柱烘箱，该烘箱也在柱前加热溶剂。如果不大幅降低系统背压，增加内管直径，减少MS分离器中不必要的管道，使用IPA进行RP净化也是不可能的。通过这些创新，我们实现了这一目标。我们不仅观察到满足环境可持续性目标的ACN使用量减少，还看到了其他几个优点，即“正交性”方法，增加了一些样品的选择性，由于IPA比ACN更具极性，因此制备分离所需的溶剂更少，并且由于较短的柱尺寸和对溶剂和柱的加热，实现了更快的纯化。实现这一过程是一项真正的工程和弹性壮举，我们很高兴在这里介绍IPA通过更快、更环保的方式为RP分离带来的好处。一个意想不到的额外优势是降低了与RP色谱相关的成本，因为对于RP-IPA纯化应用，我们对类似样品使用的IPA比ACN少大约50%。