如何使用不同的高效液相色谱柱化学以最大限度地提高方法开发的选择性

HPLC方法开发的目的是确定在合理时间内充分分离相关分析物的条件。在最终优化分离之前，获得合适的选择性应是该过程的第一步。柱化学（或更准确地说，确定保留和分离的固定相和分析物之间的相互作用机制）是可用于最大化选择性的最强大参数之一。有时C18以外的阶段可能更有用！在这篇知识库文章中，我们讨论了不同的柱化学及其相互作用机制，以了解它们如何成为快速LC方法开发的强大盟友。

介绍

选择性（α）可定义为色谱图中两个相邻洗脱分析物峰的保留因子（k）之比，如图1所示。

分离选择性可能受到许多参数的影响，包括流动相条件、固定相化学和仪器设置。已知一些参数对选择性影响较大，而其他参数的影响较小。众所周知，色谱柱固定相化学对选择性有重大影响[1]。

高效液相色谱（HPLC）是一种跨许多不同应用领域的重要技术，用于分离和量化感兴趣的分析物

在混合物中。这要求相关分析物与色谱图中的相邻峰充分分离。从实用的角度来看，分辨率可以由方程式1定义，其中

Rs = resolution, N = number of theoretical plates, α = selectivity and k = retention factor.

改变选择性、效率或保留率会影响分辨率。然而，如果我们用图形表示方程（图2），理论清楚地表明，选择性是这个数学表达式中最大化分辨率的最有力条件。

因此，为了方法开发的目的，探索柱化学和相互作用机制以最大限度地提高选择性有助于解析感兴趣的分析物。

反相LC相互作用机制

许多应用领域中最常用的柱化学是C18。

C18化学物质通常在各种条件下提供良好的性能和优异的色谱柱寿命/再现性。

它也被视为广泛适用于许多分析物类别。烷基链固定相的主要保留和分离机制是疏水相互作用。根据固定相化学，可能存在其他机制：如果固定相包含芳香环或取代芳香环（例如C18-AR或C18-五氟苯基（PFP）），并且分析物具有芳香性区域，则可能存在pi-pi相互作用。如果固定相化学中存在可极化功能（例如C18-PFP或CN-ES），则可以实现固定相和分析物之间的偶极-偶极相互作用。还知道诸如氢键（来自二氧化硅表面和极性部分，例如极性嵌入基团，例如C18-酰胺或氨基甲酸酯）和形状选择性（C18-PFP和C18）等机制。使用已发布的定义协议和测试[2]，可以确定此类机制在每个固定相上的权重。这有助于分析员了解哪些机制可以在不同的固定相下运行。表1列出了一些不同的固定相化学及其主要的相互作用机制。更多的恒星表明具有固定相位的特定机制具有更高的权重。

在LC方法开发过程中使用互补固定相增加了分析物和固定相之间的潜在相互作用，从而最大限度地提高了选择性和分辨率。优化色谱柱选择性的一种简单而有效的方法是使用一组通用的梯度条件在不同的固定相上筛选样品。图3显示了使用此方法获得的表1中每个固定相的色谱图，用于对乙酰氨基酚（作为母体化合物）和9种相关物质（添加0.5%w/w）的分析。

彩色方框突出了不同色谱柱化学性质的保留和选择性差异。绿色方框突出显示了峰4如何在母体化合物峰1之前、之后或完全同稀释。根据相互作用的机制，选择性有很大不同。红色方框突出显示峰值对7和8。虽然在所有相上通常分离良好，但观察到洗脱顺序与极性嵌入ACE C18-酰胺和ACE CN-ES固定相相反。峰9和峰10的范围从部分系数到完全系数，并根据固定相完全分离。有趣的是，从这些数据中可以注意到，与其他相相比，ACE C18-酰胺和ACE CN-ES完全分离了所有10个成分。这两个相的不同相互作用机制提供了适当不同的选择性，以获得完全的分辨率。这些数据的关键点之一是，ACE C18化学不会使用这些梯度条件分离组分。还需要进一步的工作，需要更多的时间来确定适当的分离。利用固定相化学的力量最大限度地提高选择性，有两种方案可以实现10种组分的完全分离，而无需进一步的方法开发。