健康相关研究中挥发性有机化合物的测定：综述

鉴于GC适用于挥发物分析，人们可能认为GC与细菌研究无关。然而，挥发性有机化合物正在被探索作为包括呼吸道、胃肠道和泌尿道感染在内的疾病早期诊断的生物标记物。例如，艰难梭菌感染（CDI）是世界各地流行的一种医院感染，可能由一种新的、，

采用设计酶底物释放独特VOC谱的新方法。这种使用HS-SPME-GC-MS的新方法可以与传统艰难梭菌检测方法一起使用，包括毒素检测方法，这将消除任何假阴性结果。

挥发性有机化合物（VOCs）在我们生活的世界中普遍存在。在没有任何已知激活的情况下，我们能够通过我们的嗅觉检测到大量VOC。鼻子及其固有的感官阵列，再加上我们的数据处理器（大脑），可以将挥发性有机化合物检测为一系列气味和气味，然后我们将这些气味和气味归为一系列主观描述符，例如草味、水果味、柑橘味、甜味、烟熏味、泥土味和硫磺味。我们检测大量挥发性有机化合物并确定某些描述符的固有能力仅限于我们对词汇的选择。在这种情况下，我们在各种环境中“接触”挥发性有机化合物。例如，在家庭环境中，我们会遇到挥发性有机化合物作为各种来源的气味，包括许多家用产品，例如洗涤液（柠檬/松木）；烹饪过程，例如食物制备（芳香/草药）；个人卫生用品，如肥皂和止汗除臭剂（草药/松木）。此外，我们还容易识别出一系列令人反感的气味，即恶臭。在这种情况下，我们可能会遇到与日常洗浴相关的气味（例如，所谓的厕所气味，来自胃肠道），以及与自身卫生相关的气味，例如口臭和汗水（脚臭和/或腋臭）。[注：显然，我们在许多其他情况下也会遇到挥发性有机化合物，例如环境污染物（即汽车尾气、工业过程和大气污染）。然而，在本文中，这些都被忽略了。]一系列挥发性有机化合物及其相关的主观描述如图1所示。事实上，嗅觉的艺术（因为它就是这样）需要一些“训练”；最终，我们无法确定是否所有人都将同一VOC与特定气味联系在一起（即使我们使用相同的主观描述词）。正如我们所知，我们通常在测定挥发性有机化合物时消除了人们的主观性，并使用基于气相色谱（GC）或气体传感器的仪器方法。例外的是组合式GC-嗅觉检测器，它结合了仪器和人机界面来检测气味及其浓度。

在本文的健康相关研究重点中，VOC的测定是在一系列背景下进行的[1-12]。例如，检测呼出空气中的挥发性有机化合物作为疾病的生物标志物，包括肺癌[1-6]、胃肠道疾病和肝脏疾病[7]；以及检测尿液（例如作为评估结核病患者的一种方法[8]）和粪便（例如胃肠疾病的诊断）中释放的挥发性有机化合物[9,10]。此外，还有一些优秀的综述，包括VOC分析在检测传染病，特别是呼吸道、胃肠道和泌尿道感染方面的临床应用综述[11]；此外，对细菌产生的挥发性有机物进行了广泛审查[12]。

VOCs的测定采用了一系列不同的技术，包括热脱附气相色谱质谱法[8]、固相微萃取气相色谱-质谱法[2、5、7、9、13]、顶空GC-MS[8、10]、质子转移反应质谱法[14]、，选择离子流管质谱[15]、离子迁移谱[15]以及电子鼻[1,3]。在我们的研究中，我们调查了一系列与特定细菌相关的不同挥发性有机物，特别是艰难梭菌 [13].

背景到艰难梭菌

艰难梭菌，最初命名为 艰难芽孢杆菌[16] 首次描述于1935年。然而，再过40年艰难梭菌已确定[17]艰难梭菌是一种与伪膜性结肠炎相关的革兰氏阳性、孢子形成的肠道厌氧病原体，是抗生素治疗引起医院感染性腹泻的主要传染源。艰难梭菌抗生素治疗后，肠道菌群正常平衡的改变直接导致了人体肠道的繁荣。致病菌株产生两种外毒素（肠毒素A和细胞毒素B），导致艰难梭菌感染（CDI）。CDI的主要临床症状之一是腹泻。这些被定义为容器形状[18]或布里斯托尔大便量表[19]上的7型。

诊断艰难梭菌相关疾病的当前方法

已经研究并开发了一系列方法来诊断CDI。这些包括非微生物方法（例如临床评估、内窥镜检查、粪便白细胞和乳铁蛋白）、艰难梭菌产品（如谷氨酸脱氢酶、挥发性脂肪酸和毒素），检测艰难梭菌基因（例如16s rRNA、毒素基因）和艰难梭菌（例如培养和鉴定、分型和毒素测试以及抗生素敏感性测试）[18]。实验室诊断中最常见的常规检测方法是与检测艰难梭菌粪便样本中的产品，特别是毒素。目前最常见的检测程序是免疫分析[18,20,21]；这是因为它的成本相对较低，周转快，特异性高[22]。酶免疫分析仍然存在灵敏度低的问题，导致假阴性结果[22]。因此，隔离了艰难梭菌通过培养（以及随后的毒素生产证明）被视为“黄金”标准，尽管获得结果的时间延迟了（48小时）[23]。

气相色谱法在鉴定艰难梭菌

20世纪80年代提出并研究的一种方法是，是否可以利用气相色谱（GC）的分离潜力和能力来检测挥发性代谢物，这可能表明艰难梭菌有趣的是，当时大多数研究都使用填充柱GC，与现代熔融石英柱技术（实际上是1979年开发的）相比，这种方法的分离效果较差[24]。采用了几种方法来研究GC对艰难梭菌基于VOC测定的鉴定，这些是：肉汤培养基；琼脂平板上的菌落；以及直接粪便样本分析。

Moss和Nunez-Montiel[25]使用新的熔融石英毛细管柱分离来自艰难梭菌在用乙醚对废培养基进行液-液萃取之前，将细菌在基础肉汤培养基（胰蛋白酶酵母提取物-盐肉汤）中培养5天。然后将存在的酸衍生成它们的三氟乙酰基丁酯。通过GC-FID和GC-MS分析提取物。来自废肉汤培养基的结果艰难梭菌CDC A567菌株经鉴定含有乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和异己酸。此外，还鉴定出其他主要化合物为苯乙酸和氢肉桂酸，以及适量的吲哚乙酸和2-酮丁酸以及少量的对羟基苯乙酸。两种未经鉴定的含硫化合物也从色谱柱中洗脱出来，但未经鉴定。在所有情况下，通过使用真实标准对EI和CI质谱数据库进行确认，即可获得鉴定结果。

同一组[26]使用去甲亮氨酸-酪氨酸（NT）肉汤鉴定艰难梭菌在己酸和对甲酚进化的基础上。在类似的方法中，使用液-液萃取从肉汤中提取化合物，使用乙醚或氯仿，并使用填充GC-TCD分析所得提取物。共有120株艰难梭菌调查了2株库存菌株和118株从粪便样品中分离的菌株。所有被调查菌株在培养24-48小时内在NT肉汤中产生己酸和对甲酚。确定的其他化合物包括乙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和异己酸。作者提出，从NT培养液中鉴定己酸和对甲酚对于鉴定艰难梭菌 .

该小组的进一步发展[27]使他们探索了一系列氨基酸培养基，用于艰难梭菌（特别是CDC A-567菌株）。艰难梭菌在添加了L-亮氨酸、L-去甲亮氨酸、L-isolucine、L-酪氨酸或L-色氨酸的胰蛋白酶酵母盐肉汤中培养。然后使用氯仿或乙醚提取废培养基。然后用三氯乙醇、七氟丁酐或七氟丁酸酐乙醇对提取物进行衍生，并使用填充GC和频率脉冲电子捕获检测器（为卤化化合物提供额外的灵敏度）进行分析。研究发现，无论使用何种培养基，异己酸的生成浓度都较高。有人提出，这种方法可以构成异丙酸快速检测系统的基础艰难梭菌粪便样本中。然而，据指出，依赖异丙二酸的检测可能存在问题，因为 Cl.双发酵也会产生异己酸，也可能存在于粪便样本中。作者建议，除羧酸外的其他化合物的鉴定应为区分 Cl.双发酵和艰难梭菌 .

Johnson等人采用了类似的方法[28]，对来自两个不同医疗中心的746名患者的粪便样本进行检测，以确定是否存在艰难梭菌粪便样本在添加有头孢西丁的贝克顿-狄金森补充蛋白胨肉汤中培养48小时。然后取出1 mL等分肉汤，并在56°C的酸溶液中甲基化30分钟。然后将该样品提取到氯仿中，并通过填充GC-FID进行分析。见证人：艰难梭菌可以识别出四个不同的峰：一个紧接着异戊酸之前的未解析峰；苯乙酸；异己酸；氢肉桂酸。值得注意的是，由于苯乙酸和氢肉桂酸不是挥发性酸，除非提取物没有甲基化，否则无法对其进行鉴定。作者提出，这种方法消除了对需要纯分离物的测试进行亚培养的需要。他们提出，该方法在检测四种脂肪酸方面的成功，是由艰难梭菌取决于样品的精确制备；特别是使用刚解冻的头孢西丁。不遵守程序将导致获得假阳性结果。

Sivsammye和Sims[29]采纳了Levett和Phillips（1985）的观点，使用添加了对羟基苯乙酸的肉汤来推定鉴定艰难梭菌在更快的时间范围内，即18小时。该肉汤以对羟基苯乙酸为目标，因为已经证明艰难梭菌将其脱羧生成对甲酚[30,31]。共测试了282种生物，包括47种艰难梭菌，从80名患者的脑心输注琼脂头孢西丁中分离出180个试验菌，艰难梭菌对ATCC 43593和ATCC 43584以及53种阴性对照物种进行了分析。使用的肉汤是预先还原、厌氧灭菌（PRAS）蛋白胨酵母葡萄糖（PYG）肉汤，补充有对羟基苯乙酸，用于一步鉴定艰难梭菌基于填充GC-FID对对甲酚的分析。研究发现艰难梭菌和19种确认为艰难梭菌产生对甲酚。据指出艰难梭菌未添加对羟基苯乙酸时，肉汤（PYG）中不会产生对甲酚；此外，未接种肉汤或含有对羟基苯乙酸的肉汤中未检测到对甲酚。

为了加快识别过程艰难梭菌Levett和Phillips采用了另一种方法从粪便中提取粪便[32]。识别艰难梭菌通过选择性培养基和程序从粪便中分离纯培养物和进行生化测试可能需要5天。因此，任何可以加快早期诊断的方法艰难梭菌对诊断实验室有益。在他们的研究中，他们从英国各地的医院采集了190份粪便样本，这些样本来自被认为是由以下原因引起的腹泻患者：艰难梭菌所有样品均在改良的环丝氨酸头孢西丁果糖琼脂（CCFA）培养基平板上培养，并在37°C下培养48小时。对于包装好的GC-FID分析，从含有疑似细菌生长的平板上取下琼脂塞艰难梭菌向该样品中添加1滴水，在室温下放置10分钟。然后，通过GC-FID分析1µL水提取物。纯文化分析艰难梭菌在不含抗生素的改良CCFA培养基上，鉴定出异己酸、己酸和对甲酚。此外，分析 Cl.双发酵 , Cl.聋子和 Cl.产孢菌鉴定了异己酸、己酸、γ-氨基丁酸和 d日-氨基戊酸。未接种CCFA培养基中未检测到异己酸、己酸和对甲酚；这些化合物在 酪酸氯 , 氯乙醇 ,Cl.innocuum公司或 Cl.副谷朊菌然而，可以从Cl.scatologenes NCTC 9800中识别异己酸和对甲酚（但不能识别己酸）。艰难梭菌在所分析的所有粪便样本中，有35%的样本（即66个样本）被分离出来。66份粪便样品中存在异己酸、己酸和对甲酚，确定了特征峰模式；所有这些样品都产生了艰难梭菌注意到，没有其他接种板包含所有这些代谢物。作者提出，使用改良CCFA培养基的塞子有助于确定艰难梭菌24-48小时内

GC作为毒物筛选工具的方法艰难梭菌in diarrhoeal stools was used [33]. In this case a portion of the stool sample (1.5 mL) was mixed with phosphate-buffered saline (PBS) and, after acidification, extracted with ether. The resultant extract was then analysed by packed GC-FID. Fatty acid compounds were identified by comparing their retention times with those of known standards. A total of 154 stool samples were analysed; of these, 129 samples produced no significant peak (< 1.2 cm) for isocaproic acid and were also found to be toxin-negative. The authors concluded that the lack of a ‘significant’ isocaproic acid peak was a rapid screening test for excluding艰难梭菌感染；此外，阳性结果（即确定的“显著”异丙二酸峰）必须通过毒素测试和培养检查是否存在艰难梭菌（及其相关毒素）

然而，与此形成直接对比的是，Levett[34]报告称，粪便中脂肪酸或对甲酚的GC分析作为筛选试验并不令人满意艰难梭菌在这项研究中，从英国各地疑似患有CDI的患者中采集了110份粪便样本。将50%（w/v）粪便样品悬浮液与PBS混合，酸化后，用乙醚萃取，并通过填充GC-FID进行分析。提交人报告说艰难梭菌或细胞毒素和乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸或戊酸。然而，在艰难梭菌以及异戊酸的存在（85%的粪便样本中检测到异戊酸），艰难梭菌和异己酸（41%的粪便样本中检测到异己酸）以及艰难梭菌和对甲酚（52%的粪便样本中检测到对甲酚）。然而，在艰难梭菌异戊酸、异己酸和对甲酚的联合存在。作者得出结论认为，检测异丙二酸和对甲酚的高假阴性率与其他生物体( Cl.双发酵 , Cl.聋子和 Cl.产孢菌)能够产生异己酸，使得GC方法作为筛选测试不可靠。

However, further support for the use of isocaproic acid as a marker for the screening of CDI was reported [35]. In this study [35] 90 stool samples were investigated using packed GC-FID and the results compared with both culture on a selective medium and cytotoxin assay in tissue culture. Faecal samples were extracted in either acidified ether or acidified PBS in ether. Identification of eluted compounds was done using known standards and their retention times. Using a combined determination of both isocaproic acid and butyric acid (butyric acid was chosen arbitrarily as representative of volatile fatty acids as it was present in almost all samples; 8 samples did not contain butyric acid) the authors were able to identify three categories: positive, negative and indeterminate. A positive result was indicated by isocaproic acid having a peak height > 0.5 cm; for samples with a peak height ≤ 0.5 cm were also considered positive provided the peak height for butyric acid was ≤ 5 cm. Negative samples were characterised by having either no signal for isocaproic acid or a signal ≤ 0.5 cm and butyric acid > 5 cm. Samples were classed as indeterminate if they had no discernible peak for isocaproic acid and a peak for butyric acid of ≤ 5 cm. By excluding the indeterminate group it was possible to use the predictive capability of GC to confirm 87% of positive cases and 85% of negative cases compared to culture on a selective medium (cycloserine-cefoxitin-fructose agar) and 71% of positive cases and 95% of negative cases compared to cytotoxin assay. The authors identified that the number of false positives was relatively small (11%) when compared to the culture method; however, the percentage of false negatives was large (41%). In comparison with the cytotoxin assay however the percentage of false negatives was fewer (27%). They concluded that their semi-quantitative approach using isocaproic acid and butyric acid provided a rapid provisional diagnosis with a high predictive value in at least 2/3rds of cases. They suggested that their GC approach could be helpful to decide whether to start prompt and appropriate treatment while obtaining definitive diagnosis of艰难梭菌通过替代方法，如细胞毒素检测，以及关于患者治疗的进一步决定，与疾病相关。

使用GC从艰难梭菌然而，在临床环境中，由于报告的结果相互矛盾，作为一种合适的前进方式，被迅速拒绝[18,32]。然而，气相色谱技术的发展，包括有效分离多组分混合物的能力，以及作为检测器选择的质谱仪的使用，意味着近年来一些研究重新融合[37，38]。De Preter等人[38]的论文关注的是筛选粪便样本的净化和捕集系统的优化；然而，提供了来自健康志愿者11份粪便样本中挥发性有机物的身份数据。对粪便样本的分析确定了135种不同的挥发性有机化合物，其中22种存在于所有志愿者中。相反，Garner等人[37]使用SPME-GC-MS研究了健康献血者和胃肠道疾病患者（包括艰难梭菌). 共获得111份粪便样本，其中22份来自患有艰难梭菌该研究在所有样品中鉴定出297种挥发性有机化合物，其中以下物质存在于所有样品中：乙醇、丁酸、戊酸、苯甲醛、乙醇、二硫化碳、二甲基二硫、丙酮、2-丁酮、2,3-丁二酮、6-甲基-5-庚-2-酮、吲哚和4-甲基苯酚。特别是在确诊为艰难梭菌对无症状志愿者、空肠弯曲菌患者、，艰难梭菌或溃疡性结肠炎，并被发现将病例分为4组。作者指出，SPME-GC-MS是一种快速定性分析粪便样品VOC谱的有效方法。他们还假设，通过鉴定少量化合物，可以区分疾病。

天然气的开发

基于色谱的鉴定方法艰难梭菌

因此，如果GC有任何早期诊断艰难梭菌新方法试图利用之前的工作[30，31]，这些工作表明艰难梭菌将对羟基苯乙酸脱羧生成对甲酚。所开发方法的基础是向样品中添加一种设计酶底物，该底物将释放一种独特的挥发性有机化合物特性艰难梭菌只有。选定的设计酶底物是3-氟-4-羟基苯乙酸（FHPAA），它会在艰难梭菌释放VOC 2-氟-4-甲基苯酚。

实验

化学品和试剂

异丁酸（99%）、丁酸（≥99%）、异己酸（99%，己酸）、对甲酚（99%）和3-氟-4-羟基苯乙酸（98%）以及D-环丝氨酸、两性霉素和头孢西丁钠盐购自Sigma-Aldrich（Poole，UK）。2-氟-4-甲基苯酚（98%）取自Alfa Aesar（英国莫克姆）。所有溶剂均为分析试剂级，从Fisher Scientific（英国拉夫堡）购买。熟肉颗粒和CCEY琼脂（环丝氨酸头孢西丁蛋黄琼脂或巴西琼脂）来自BioConnections（英国韦瑟比）。脑心灌注（BHI）肉汤和哥伦比亚血琼脂购自Oxoid（英国贝辛斯托克），牛磺胆酸钠（≥90%）购自Calbiochem（英国诺丁汉）。显色琼脂色度ID艰难梭菌用于测定方法灵敏度的方法来自bioMérieux（法国Marcy l&#39;Etoile）。用于提取细菌VOC的SPME纤维（85µm聚丙烯酸酯（PA））购自Supelco Corp.（美国宾夕法尼亚州Belleforte）。按照制造商指南的指示，在使用之前，所有纤维在GC注入口中进行调节。所有纤维均使用手动支架。

仪表

在Trace GC Ultra和Polaris Q离子阱质谱仪（Thermo Scientific，Hemel Hempstead，UK）上使用Xcalibe 1.4 SR1软件进行气相色谱/质谱（GC/MS）分析。使用30 m x 0.25 mm ID x 0.25µm VF-waxMS毛细管柱分离挥发性有机化合物（英国斯托克波特安捷伦科技公司瓦里安）。使用的温度程序是：50°C保持2分钟，然后以10°C/min的速度增加到220°C，最后保持2分钟。将无分裂注入口保持在230°C，以便以1:10的分裂比以分裂模式解吸挥发物。以1.0 mL/min的恒定流速将氦用作载气。MS参数如下：全扫描模式，扫描范围50–650 amu，扫描速度为0.58扫描/s。离子源温度为250°C，电离能为70 eV，质量传输线为250°C。

VOCs的识别是通过使用国家标准与技术研究所（NIST）参考库（NIST质谱库，版本2.0a，2001）以及真实标准的保留时间和质谱的比较实现的。此外，使用真实化合物的质谱建立了一个专门的质谱库，以确认检测到的挥发性有机化合物的身份。

微生物学

艰难梭菌核糖体R-015、R-106和R-064来自泰恩河畔纽卡斯尔弗里曼医院微生物科。所有细菌在含有5%去纤维马血的哥伦比亚血琼脂上进行亚培养，并在37°C厌氧条件下培养。粪便样本为临床样本，从弗里曼医院微生物科获取，确认为艰难梭菌培养阳性、毒素阳性或艰难梭菌培养阳性、毒素阴性或艰难梭菌培养阴性，毒素阴性。对所有粪便样本进行GDH（谷氨酸脱氢酶）测试，GDH是一种由艰难梭菌.培养艰难梭菌，个样本首先受到酒精休克。这包括用等体积的96%乙醇乳化少量样品，并在室温下放置30分钟。然后，将50µL该悬浮液接种到CCEY琼脂上，并在37°C下厌氧培养平板48小时。的增长艰难梭菌通过菌落外观、紫外线下的荧光和MALDI-TOF-质谱法进行鉴定（英国考文垂布鲁克）。测试样品是否艰难梭菌毒素阳性或阴性，样品通过VIDAS毒素A/B检测系统（bioMérieux，Marcy l&#39;Etoile，法国）。这涉及到亚培养艰难梭菌放入煮熟的肉汤中，孵育48小时。然后以13000转/分的转速将等分的肉汤离心5分钟。然后用VIDAS毒素A/B检测系统对上清液进行检测。

HS-SPME GC/MS程序

从样品顶部空间提取细菌挥发性有机化合物，并在热GC进样口解吸之前通过SPME进行浓缩。在提取VOC之前，所有样品在37°C水浴中保持30分钟，并在整个取样过程中保持该温度。带有PA涂层的熔融二氧化硅SPME纤维刺穿PTFE隔膜，并在小瓶顶部空间中暴露10分钟。所有纤维在使用前均按照制造商指南进行调节。提取VOC后，立即将SPME纤维暴露在热GC注入口中2分钟，以解吸细菌VOC。

结果和讨论

细菌挥发性有机化合物的鉴定和定量

将已知浓度的VOC标准加入10 mL熟肉肉汤中，加入2.5 g/L牛磺胆酸钠、250µg/mL D-环丝氨酸、，添加8µg/mL头孢西丁和4µg/mL两性霉素，然后在37°C下培养加标空白，然后提取挥发性有机化合物。HS-SPME程序和GC/MS参数与用于细菌VOC分析的参数一致。使用外部校准对挥发性有机物进行量化，检测限（LOD）和定量限（LOQ）的值分别确定为峰面积的3倍信噪比和10倍信噪比值。结果如表1所示。

方法在粪便样本中的应用

开发的粪便样品分析方法如下：所有样品经受酒精冲击，以13000 rpm离心5分钟，去除乙醇，并将固体接种到10 ml熟肉肉汤中。肉汤中含有250µg/mL D-环丝氨酸和8µg/mL头孢西丁、4µg/m L两性霉素、100µg/mLFHPAA和2.5 g/L牛磺胆酸钠。该方法用于100份粪便样本的盲法研究，并对VOCs进行量化。每天取样期间，对10 mL空白熟肉汤进行分析。经（HS-SPME-GC/MS）分析，粪便样本确认为60份培养阳性、毒素阳性；17例培养阳性，毒素阴性，23例培养阴性，毒素阴性。通过HS-SPME-GC/MS获得粪便样品的典型色谱图艰难梭菌培养ve和毒素ve；艰难梭菌培养ve和毒素-ve；和，艰难梭菌培养物-ve和毒素-ve如图2所示。表2总结了每个粪便样本中六种挥发性有机化合物的浓度，而整个样本数据集的统计分析如表3所示。结论是，2-氟-4-甲基苯酚在艰难梭菌积极的和艰难梭菌阴性样本。无法区分艰难梭菌阳性毒性阳性和阴性毒性。没有其他脂肪酸或对甲酚提供任何形式的选择性来区分艰难梭菌阳性和阴性样本

结论

所开发的方法允许确认是否存在艰难梭菌18小时后具有很高的特异性（100%）。这种创新方法利用新的酶底物释放出细菌培养物中通常不存在的不寻常VOC，可以应用于临床或食品微生物学中其他细菌病原体的检测。

感谢bioMérieux SA的财务支持。斯旺西大学EPSRC英国国家质谱设施获得了高分辨率质谱。此外，还感谢E.Ludkin先生和Gary Noble先生的技术支持。