使用微溶液SPE加速大麻使用测定样品制备

虽然尿液检测已成为实验室的常规工作，其任务是寻找吸食大麻或其他含大麻产品的证据，但由于其非侵入性取样程序，口服液正在成为一种有吸引力的替代品。然而，由于口服液中药物和代谢物的水平很低，因此需要一种非常灵敏的分析方法。在本文中，我们描述了一种使用微溶液SPE的新样品制备程序，该程序减少了从尿液和口服液中生成用于对THCA进行LC-MS/MS分析的样品所需的时间和工作量。LC-MS/MS方法对尿液中THCA的定量限（LOQ）低于1.5 ng/mL，口服液中THCA的定量限低于10 pg/mL。

介绍

大麻是最常用的药物之一，因为它具有精神活性，因此经常在法医学和毒理学分析中发现[1]。虽然大麻和其他形式的大麻的使用已经非法一段时间了，但大麻和其他大麻正在世界各地被接受，包括美国的一些地区，用于医疗和娱乐用途。由于这种广泛使用，实验室迫切需要快速可靠地分析样本，以检测大麻和大麻消费。

THC（（-）-Δ9-四氢大麻酚）是大麻和大麻制品中的主要精神活性成分。在体内，THC被代谢成THC-OH（（±）-11-羟基-Δ9-四氢大麻酚），这也是精神活性物质，而THCA（（±）-11-nor-9-羧基-Δ9-四氢大麻醇），这不是精神活性物质。这些代谢物在食用后会持续数天，因此可以用作近期大麻使用的标记[2]。血液可以包含所有三种成分，而尿液通常只包含THCA。口服液中可同时含有THC和THCA。然而，在吸食大麻的环境中，THC有可能从被动接触的口服液中收集大麻，因此需要进行THCA检测，以最终从口服液样本中识别大麻消费。

检测和量化这些化合物的色谱方法最初是基于GC-MS[3-4]开发的，但这种方法需要在分析之前进行大量的样品制备和衍生化。最近，LC-MS/MS在这些分析中得到了更广泛的应用和接受，通过消除衍生步骤提供了简化的工作流程[5-6]。LC-MS/MS还允许对其他药物进行并行分析，从而扩大了单一测试的范围，从而具有灵活性。

样品制备在涉及生物流体或组织的任何分析中都起着重要作用，因为这些基质中有许多成分要么与分析系统不兼容，要么对目标化合物产生干扰。例如，血液中含有高浓度的蛋白质和磷脂，这可能会污染分析柱，并导致MS检测过程中的离子抑制。尿液中含有高浓度的盐，会在整个系统中沉淀，尤其是在离子源处，因此需要频繁维护。

已经描述了从尿液和口服液中提取THC及其代谢物的不同方法，主要涉及液-液萃取（LLE）[7]或固相萃取（SPE）[8-9]。尽管这些技术能够有效地去除对分析产生负面影响的基质成分，但它们需要大量的时间和溶剂，而且多个步骤可能会导致引入误差和不精确性。

微溶液SPE基于比SPE通常使用的更小的介质床重（2 mg）。虽然较小的床层比较大的床层具有较低的负载能力，但基于微溶液SPE的方法在洗脱过程中使用较少的溶剂，因此受益匪浅。这减少了分析重组前蒸发所需的时间，或者可以完全消除这一过程，这对于减少可能对回收产生不利影响的非特异性结合具有显著优势，尤其是对较大分子的回收。

在本文中，提出了新的样品制备方法，用于分析尿液中的THCA以及口腔液体中的THC和THCA，从而能够在使用该矩阵积极识别大麻使用所需的低水平上可靠地检测和量化THCA。样品制备基于使用聚合物混合模式（反相/强阴离子交换）吸附剂的微溶固相萃取，能够使用较小的样品和洗脱体积来促进LC-MS/MS分析，而无需蒸发和重新配制提取物。在SRM模式下，使用三级四极质谱仪进行质谱检测。

实验

材料

THC、THC-d3、THCA和THCA-d3作为MeOH溶液从Cerilliant Corporation（Round Rock，TX）购买。LC-MS Optima级水和乙腈以及LC/MS级甲酸购自Fisher Scientific（马萨诸塞州沃尔瑟姆），并按供应使用。从志愿者处获得人类尿液和口腔液样本，并在使用前进行测试，以确保其不含THC和THCA。

仪表

使用Thermo Scientific进行分离™ UltiMate公司™ 3000 RSLC系统连接至Thermo Scientific™ TSQ Endura公司™ （尿液）或Thermo Scientific™ TSQ Quantiva公司™ （口服液）三级四重质谱仪，每个质谱仪都配有加热的电喷雾电离源HESI II。

样品制备

使用Thermo Scientific进行固相萃取™ SOLAµ™ 尿液和口服液样本均使用SAX（2 mg/1 mL，96 well平板）。尽管两种基质使用了不同的样品预处理程序，但SPE程序是相同的。图1总结了完整的样品制备程序。

尿液在固相萃取之前用浓NaOH进行碱水解处理，以将THCA-Glucuronide转化为其天然形式，从而简化数据分析和解释。水解过程中使用硅烷化小瓶，以减少THCA与小瓶壁的结合。向100µL尿液中添加10µL内标（THCA-d3，ACN中150 ng/mL）和20µL 9M NaOH，并将样品在60°C下培养20分钟。冷却后，用200µL ACN稀释样品，并用10µL冰醋酸中和。使用200µL 20 mM NH4OAc进行最终稀释，以制备用于固相萃取程序的样品。

在提取之前，通过温和的蛋白质沉淀处理口腔液。用200µL ACN和25µL内标溶液（THCA-d3为1 ng/mL，THC-d3为10 ng/mL）处理组合口服液和保存缓冲液（总体积为750µL，含有250µL口服液），然后用50µL 1%NH4OH溶液处理。

然后将处理过的样品装入SOLAµSAX微孔板中，并在真空下抽出。样品用200µL H2O/ACN（50:50 v:v）清洗，然后用ACN/甲酸（95:5 v:v™ Web密封™ 玻璃插入板。用两份50µL的等分样品洗脱尿液样品，用两份30µL等分样品洗脱口腔液样品。在注射之前，用H2O将提取物稀释为1:1。

色谱和质谱检测

使用Thermo Scientific进行LC分离™ Accucore公司™ RP-MS分析柱（100 x 2.1 mm，2.6µm），流动相A在水中含有0.1%甲酸，流动相B在乙腈中含有0.1%乙酸，流速为0.40 mL/min。将60%B的初始流动相组分保持0.50分钟，然后向95%B施加线性梯度3.0分钟，再保持0.50 min。流动相恢复到柱平衡的初始条件，导致总运行时间为5.0分钟。使用表1中列出的离子源条件和MS/MS跃迁，在SRM模式下获取质量数据。

结果和讨论

THCA和尿液

在测定尿液中THCA的含量时，应使用强碱水解样品，将存在的任何THCA-葡萄糖醛酸盐转化为非合成形式，以简化分析和数据解释。尽管可以在中和和稀释后注入水解样品，但这会引入污染物和潜在干扰，可能会对分析柱的使用寿命以及质谱仪的整体清洁度和灵敏度产生负面影响。固相萃取是一种可以产生更清洁样品的替代方法。然而，任何涉及固相萃取的方法都应尽可能简单，以便于快速制备样品并减少潜在误差。

这里开发的程序包括用浓NaOH进行碱水解，然后进行稀释和中和。然后从水解样品中提取分析物，然后使用混合模式（反相/强阴离子交换）吸附剂进行微溶固相萃取。这种材料为酸性分析物提供了高选择性，从而产生了更清洁的提取物，可以消除更多的污染物和干扰，从而产生更好的分析柱寿命，并缩短仪器维护间隔。使用含有5%甲酸的乙腈进行洗脱，生成样品，在用水稀释后可注入LC-MS/MS系统，消除了常见的蒸发和重组步骤，同时仍满足必要的检测限。

Guidelines provided by the Substance Abuse and Mental Health Services Administration (SAMHSA) set a cutoff for a positive THCA determination in urine is 15 ng/mL [10]. To ensure that the method would meet requirements by having a limit of detection at or below 10% of the cutoff value, linearity was determined by spiking blank urine with THCA in concentrations from 0 to 100 ng/mL. The ratio of the peak area for THCA to the peak area for the internal standard (THCA-d3) was used to calculate the response for each sample. Linear response over the full range was observed with no weighting (R2=0.9992) (Figure 2a) with the lowest concentration standard (1.5 ng/mL) showing more than adequate signal-to-noise (Figure 2b). Although a true limit of detection was not determined for the method, this result suggests that it is well below the 10% of cutoff threshold.

通过比较三种不同浓度（1.5、15和40 ng/mL）萃取前后添加THCA的样品的THCA峰面积，评估固相萃取过程中THCA的回收率。在每个浓度水平下进行六次重复。在所有三个水平上，THCA的回收率均大于92%，具有较高的再现性，%RSD小于5.4%。通过比较提取后加标样品与通过向洗脱溶剂中添加相同数量的THCA制备的样品，可以观察到最小的基质效应。

通过在空白尿液中加入浓度高于和低于截止限值的THCA来制备质量控制样品。提取并分析这些样品，并将计算浓度与实际浓度进行比较。在每个浓度下分析六个重复。对于所有样品，计算的THCA浓度与实际浓度一致，在5%以内。

口服液中的THC和THCA

由于药物和代谢物的浓度通常低于尿液和血液等其他液体，因此口服液是一种具有挑战性的基质[11]。例如，虽然测定尿液中THCA水平的分析方法只需适用于约1.5 ng/mL的浓度，但测定口服液中THCA的方法必须能够在约10 pg/mL的水平下进行检测和定量[12]。

上述尿液样品制备程序的变化已应用于口服液。样品预处理已修改为更适合不同基质，使用乙腈稀释以帮助去除蛋白质和溶解THCA。同样，虽然可以在简单稀释后分析口服液，但固相萃取通常是更好的方法，因为样品可以通过萃取程序浓缩下来。采用类似的固相萃取程序，使用SOLAµSAX和混合模式反相/强阴离子交换吸附剂，使用乙腈和5%甲酸洗脱，注射前用水稀释。

定量限（LOQ）定义为反向计算值在20%以内的最低浓度，五个QC重复的RSD在20%以内。根据这些标准，口服液中THCA和THC的定量限分别为10 pg/mL和0.5 ng/mL。THCA和THC的线性分别为0至1000 pg/mL和0至1000 ng/mL。最低标准物的校准曲线和色谱图如图3a、b所示（THCA）和图4a、b（THC），这两种化合物在浓度范围内均表现出线性响应。

通过在SPE前后将50 pg/mL THCA和5 ng/mL THC添加到五个供体样品中来测定回收率。这些样品显示THCA和THC的平均回收率分别为98.1%和61.6%。

通过向口服液中添加三种不同浓度的THCA和THC（THCA为25、100和500 pg/mL，THC为2.5、10和50 pg/mL），制备用于测定样品制备和分析程序精确度的样品。在三个单独的批次中对四个重复进行分析。这些样品的%RSD对于THCA小于8.5%，对于所有三种浓度水平的THC小于3.2%（表2），这表明该方法用于产生精确分析物浓度的可靠性。

结论

在本报告中，我们展示了一种基于微溶液SPE的尿液和口服液样品制备方法。该方法能够从样品中快速提取分析物，具有较高的回收率和精确度。更重要的是，该方法比使用传统SPE格式的方法需要更少的步骤和更少的时间。在LC-MS/MS分析之前，无需蒸发和重组即可分析提取物，而只需稀释即可。该方法已被证明适用于达到分析口腔液中THCA所需的极低检测限。