唯一比超高速更快的是瞬时

摘要

传统液相色谱（LC）的局限性阻碍了药物发现过程中候选化合物的真正高通量筛选，例如方法开发、样品制备和样品吞吐量，使其无法更广泛地应用。声喷射质谱法（AEMS）利用声滴喷射（ADE）技术与开放端口接口（OPI）相结合，使样品分析速度比传统LC-Mass光谱法快50倍。

需要加快高通量药物研发

今天的药物发现涉及对数千甚至数百万潜在候选药物的大规模化合物库进行评估。高通量筛选（HTS）用于评估分子的药代动力学（PK）特性，对于在实际时间内选择候选药物至关重要。由于速度原因，分析通常使用平板读取技术进行，但存在固有的开发成本和特异性问题。液相色谱法（LC）或高效液相色谱（HPLC）用于分离和质谱（MS）用于检测具有特异性和信息丰富的数据，但目前缺乏更广泛适用的速度。

当使用平板读取技术时，输出通常基于产生吸收或发射的化合物的反应。这是一个简单的终点，但缺乏具体性，开发和故障排除可能变得复杂。通常需要二次筛查来评估假阳性。由于样品制备和分离工作流是HTS的速率限制瓶颈，LC-MS/MS方法目前具有较高的特异性，但吞吐量较低。需要简单的超高通量采样，直接测量产品和底物，实现复杂生物学的高温超导筛查，并提供明确的终点，以减少模糊性，并能够更好地决策开发过程中的治疗进展。

通过LC消除简化

声喷射质谱（AEMS）结合了声滴喷射（ADE）技术和开放端口接口（OPI）技术[1]，实现了直接非接触采样到电喷雾电离质谱仪（ESI-MS）中。它有可能消除与基于LC-的样品引入相关的限制。同时，该技术以与HTS现有平板阅读器技术相同的速度提供了超快速采样，但具有MS的特异性和信息丰富的数据。

使用AEMS，通过应用聚焦在样品井底部的声波喷射出纳米石粒大小的样品液滴。从微孔板喷出的样品被捕获到OPI的涡流中。然后用载体溶剂对样品进行稀释，并直接送至电喷雾源，通过常规电喷雾进行电离，并通过质谱仪进行检测（图1）。不需要注射针或回路。样品引入MS是通过ADE与OPI的非接触交互实现的，实际上消除了样品间的夹带，即使在浓度极限之间移动。由于OPI中发生的稀释效应，基质抑制效应也基本上被消除，允许在药物发现中对大多数分子进行清洁和敏感的分析。

推动吞吐量障碍

Boehringer Ingelheim的研究人员成功地将AEMS装置应用于ESI-MS，使用ADE-OPI-MS装置进行高通量药物代谢和药代动力学分析，使用右美沙芬和d3-extrophan（每个100nM）作为模拟物[2]。ATS-G4P声滴发射系统与QTRAP®6500质谱仪的接口以及改进的OptiFlow®Turbo V离子源导致了ADE-OPI-MS设置的创建。各种修改和附加设备导致了一个系统，该系统将ESI-MS的速度限制提高到3 Hz（或每秒3个样本），以进行采样和检测，并对每个样本进行基线分离。

在3 Hz的采样率下，非接触式样品注入方法比最快的基于ESI的系统花费的时间少得多（速度快7.5倍），甚至比MALDI在2.5 Hz时的最大高通量筛选吞吐量还要快[2]。此外，使用较低的1或3 Hz采样率，对含有高浓度血浆、细胞裂解物和其他基质（酶分析缓冲液和粗犬血浆）的未处理样品进行分析，而未观察到离子抑制，这表明注射前可以保持样品的生理状态[2]。

加快药物发现

由于没有液相色谱要求，AEMS无需开发分离方法，排除液相色谱问题，并等待液相色谱柱清洗和平衡，分析物洗脱。对于相同数量的样品和化合物，可能有更快的周转时间，或者可以在与传统LC-MS相同的时间框架内分析更多化合物、更大的样品集和更大的队列。因此，可以更早地发现死胡同和误报，使团队能够更快地做出关键决策，并将项目周转时间从数月缩短到数周、数天甚至数小时或数分钟。

尽管在快速筛选反应条件的高通量技术方面取得了重大进展，但收集分析数据一直是一个问题。使用当前的MS系统，分析高密度实验可能需要数小时或数天。辉瑞公司的科学家表明，将超吞吐量（UT）阅读器平台与ADE-OPI-MS相关的直接采样相结合，可以克服这一限制，并支持并行药物化学和反应筛选工作[7]。

在这项研究中，有三组实验

模拟标准高通量实验（HTE）和平行药物化学（PMC）筛选过程：

1.在可变催化剂和碱条件下对单一转化（3-溴吡啶与4-苯基哌啶的钯催化C−N偶联）进行反应优化。

2.药物类小分子库的平行合成，涉及常见模板结构与不同单体试剂的反应（两个二级胺模板的酰胺化，每个模板与96个羧酸共192个反应）。

3.类似的文库合成，但涉及较大模板底物与小分子试剂的反应（具有胺反应点的市售DNA片段与一组96种酸之间的酰胺形成）。

将每个ADE-OPI-MS实验的结果与使用主流高通量MS平台获得的结果进行比较。在这三种情况下，所需的样品要少得多（几毫微升vs.几十毫微升或微升），这样可以节省更多的材料用于进一步分析。采样速度也快了一个数量级，例如实验2中ADE-OPI-MS约7.5分钟，UHPLC-MS约5小时。

重要的是，ESI-MS的使用提供了准确的定量数据，与使用LC-MS获得的数据类似，并且优于使用MALDI观察到的数据，而无需内部标准，即使是涉及较大复杂物种的反应，如合成修饰寡核苷酸。此外，覆盖范围大于MADLI的可能覆盖范围。此外，使用高分辨率TOF MS仪器可以明确识别较小和较大的基质。

虽然所有分析都是在反应淬灭后离线进行的，但研究人员建议，由于能够在不需要任何样品清理的情况下直接取样，因此可以使用ADE-OPI-MS进行在线反应监测，从而可以实时评估反应动力学。

可再现的分析性能

尽管消除了LC，但通过ADE向OPI快速交付样品提供了可重复的性能，如Echo®MS系统（加利福尼亚州红木市SCIEX）所示。当分析每口井在10%v/v甲醇/水溶液中含有100 nM右美沙芬的384孔板时，所有384口井的MRM峰面积均达到1.98%（图2）。此外，在7分钟内对所有384口井进行了分析[4]。

Furthermore, when a ‘droplet ladder’ study of 1 to 20 droplets (10 replicates for each) was generated from one of the dextromethorphan sample wells, the %CV obtained for the 10 replicates across the droplet ladder was <3% with excellent linearity and R2 of 0.9997 (Figure 3) [3]. The ability to specify the number of droplets is analogous to adjusting an injection volume in standard HPLC work.

只需少量样品制备

Boehringer Ingelheim研究人员观察到，即使对于复杂或“肮脏”的样品，也能实现这种类型的再现性。对于芬太尼在蛋白沉淀血浆、1:1水血浆和未处理血浆中的溶液，与传统LC-MS的结果不同，未处理血浆溶液在建立浓度曲线方面表现最佳（图4）[4]。

出现这种结果是因为在AEMS中，当来自ADE的样品液滴进入OPI时，溶剂会将液滴扫送到质谱仪。这种内置的“稀释并拍摄”过程最大限度地减少了通常将直接血浆注入MS所产生的基质抑制效应。结果是，分析物的电离效率更高，灵敏度更高——所有这些都无需任何样品制备。

进一步的研究涉及酵母发酵液中血管紧张素的分析（图5）[5]。通过用4:1 v/v乙腈/水溶解活性肉汤并添加血管紧张素标准物以代表肉汤中的25、30和50 mg/L血管紧张素来制备样品。然后用40:60 v/v乙腈/水将样品稀释至1x、10x和100x稀释液，然后以14000 rpm离心15分钟。

在所有稀释液中观察到具有一致精确定量的极高再现性，即使是最小稀释样品。即使使用如此复杂的基质，也几乎不需要样品制备。

克服矩阵抑制效应

除了提供可接受的灵敏度、再现性和线性水平外，AEMS方法还抵消了LC-MS方法通常观察到的基质抑制效应。通过分析用PEG400强化血浆制备的标准品，使用Echo®MS系统证明了这种行为，这些标准品在处理数据时被视为质量控制[6]。PEG400是药物研究中常用的制剂，在电喷雾质谱中具有显著的抑制作用。

以102.4 ng/mL水平的未处理血浆中不同水平的PEG400的影响为例，见表1。其他浓度下的标称偏差与两个PEG400水平的102.4水平非常相似。

广泛适用性

除了高通量平行药物化学[2]外，AEMS还被用于许多应用领域，包括高通量药理学筛选、无标签原位酶动力学以及体内外吸附、分布、代谢、消除、药代动力学（PK）和生物标记物分析[6]。无论是分析化学反应还是进行体内和体外生物分析定量，AEMS方法都优于传统技术。

AEMS有潜力最终推动MS在许多以前被认为不切实际的领域中的应用。AEMS还可用于制药行业以外的许多其他需要高采样速度的领域，如合成生物学、食品和环境分析。在所有这些应用中，科学家都能从简单和快速中获益，并对其结果更有信心。

改变药物发现的潜力

ESI-MS的使用在灵敏度、再现性和线性动态范围方面具有良好的定量性能，且无残留，适用于广泛的分析物。很明显，AEMS方法在保持或改进传统技术的分析性能的同时，显著提高了样品分析。对于常规分析，使用此革命性平台的速度和简单性为高周转率生物分析实验室提供了一个有吸引力的解决方案。

AEMS技术也可能有潜力改变药物发现和精确治疗的发展。在寻找安全有效的药物的过程中，决策速度对发现过程和确定应进一步开发的潜在靶点至关重要。AEMS有可能从头到尾影响整个工作流程，包括样本准备、数据采集和数据处理，旨在缩短时间，以生成关键决策中使用的数据。