真空辅助顶空固相微萃取：橄榄油分析的有力工具

比较了真空辅助顶空固相微萃取（Vac-HS-SPME）和常规顶空固相微量萃取（HS-SPME）分析外橄榄油的性能。Vac-HS-SPME特别适用于半挥发性化合物，显著改善了萃取动力学。此外，对于粘性油样品，将样品加热和真空的效果结合起来证明是有益的，因为它降低了样品的粘度，增加了化合物在液相中的扩散性，并改善了挥发性较低的化合物的挥发。

1.简介

挥发性次级代谢产物是一类重要的化合物，在许多应用领域，如临床[1-3]、环境[4-7和食品[4,8,9]。在后者中，挥发物可以提供关于植物和地理起源和/或食品质量的高度信息提示，包括香气特征、腐败或对次级代谢物特征的技术影响。挥发性代谢物对许多高价值食品起着至关重要的作用，特级初榨橄榄油是一项紧迫的挑战。目标是用一种更加客观和稳健的方法支持官方传感器评估。

顶空固相微萃取（SPME）是最广泛应用于挥发性分析和指纹图谱的方法，因为它提供了简单的自动化、无溶剂应用和灵活性，因为市面上可买到不同的吸附剂[10]。HS-SPME是一种基于三相平衡的技术，即取样头空间光纤。根据分析物和样品的物理化学性质，可以在几分钟或几个小时内达到平衡。因此，需要在灵敏度和吞吐量之间进行折衷。

将这种危害降至最低的一种令人兴奋的可能性是在取样过程中使用减压条件，这是一种称为真空辅助HS-SPME的技术。Psillakis等人[11]出版的一篇教程有效地阐明了水基和固体样品的理论。最近，该理论被扩展到含油样品[12]。从热力学角度来看，平衡浓度不受减压条件的影响[11,13]，而动力学主要取决于介质、温度和压力。这意味着当温度升高和/或压力降低时，传质增加[11,13]。

HS向SPME纤维的传质不被视为一个限制过程[14,16]，而从液体到HS的传质虽然高度依赖于分析物基质，但通常是限制步骤[11,16]。这一行为可以通过考虑液体/HS界面上滞留膜层中的浓度梯度来解释，假设两相的主体充分混合。事实证明，这种理论成功地描述了水基样品中的Vac-HS-SPME过程[11,14]。最近[12]，有人澄清，从液体到HS（1/kO）的总阻力是由两个串联的扩散阻力引起的，即气相阻力（1/（KGL-kG））和液相阻力（1/1kL）之和，特别是对于作为橄榄油的粘性液体，根据下式：

式中，kG和kL是气体和橄榄油边界层的传质系数，KGL是气相-油分配系数，代表气相平衡浓度与液相平衡浓度之比。此外，粘性液体样品中应考虑扩散率，这会导致与水相相比，液膜中的阻力增加[17]。另一方面，无论选择何种模型来描述，气相中的扩散系数与系统中的总压力成反比[14]。因此，采用Vac-HS-SPME进行取样有利于气相阻力控制其挥发速率的分析物，改善其萃取动力学，而对于限制过程为液体扩散的化合物，温度将起到有益的作用。

本工作旨在研究真空-HS-SPME在外橄榄油剖面上的采样，比较减压和常压条件下的萃取温度和时间剖面。

2.材料和方法

2.1.化学品和试剂

使用溶解在己烷（HPLC级，MilliporeSigma®，美国）中的正构烷烃混合物（C7-C30）（Supelco，美国）计算线性保留指数（LRI），以确认峰特性。使用了长度为50/30µm 1 cm的二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）纤维（由Millipore Sigma提供，美国宾夕法尼亚州Belleforte）。

Extra-virgin橄榄是在当地一家超市（比利时Gembloux）购买的。

2.2.常规和减压条件下的HS-SPME程序

纤维在首次使用前按照制造商的建议进行调节。定期运行空白，以验证是否存在结转。

将1.5 g油样称重至20 mL螺旋瓶中（Restek，Belleforte，USA）。允许样品在设定的萃取温度（30°C和43°C）下与顶空平衡5分钟。然后，将SPME纤维暴露于顶空，并在所选采样时间（10、20、30、40分钟）搅拌（250 rpm）下进行采样。

将纤维在250°C下解吸2分钟（1:5），进入配备SPME玻璃衬里的GC-MS入口。所有实验均一式三份。

The difference between regular and Vac-HS-SPME is in the vial cap used. For the former, metallic caps with a central hole and a polytetrafluoroethylene (PTFE)/silicone septa (Restek, Bellefonte, USA) were used. For Vac-HS-SPME a custom-made closure design was implemented (provided by the Laboratory of Aquatic Chemistry, School of Environmental Engineering, Technical University of Crete [18]). The air inside the vial was evacuated for 1 min using a MD 4C diaphragm vacuum pump (7 mbar = 0.007 atm ultimate vacuum without gas ballast) (Vacuubrand GmbH & Co KZ, Wertheim, Germany). Then a 5 mL gastight syringe (SGE, Australia) was used to introduce 1.5 g of oil samples in the vial (Figure 1).

2.3.中央组合设计

中心复合实验设计（CCD）用于优化常规和Vac-HS-SPME的萃取温度和时间。根据之前工作中报告的条件，在30°C至55°C之间测试萃取温度，并在10至30分钟内测试暴露时间[19,20]。

2.4.GC-MS分析

所有分析均使用安捷伦7890B GC与5977 MSD耦合。载气：氦气，流速为1 mL/min。GC柱：30 m x 0.25 mm i.d.x 0.5μm df SLB-5ms毛细管柱[（硅苯聚合物，在极性上几乎等同于聚（5%二苯基/95%甲基硅氧烷）]，购自MilliporeSigma（宾夕法尼亚州Belleforte，美国）。GC烘箱温度程序：35°C（保持2分钟）至250°C，3°C/min；300°C，25°C/min。

MS：在70 eV的EI模式下；源温度：230°C；四极温度：150°C；35-500 m/z范围内的全扫描模式。

2.5.数据整理和统计分析

在整个色谱图中选择了12种化合物（表1）。所选12种化合物的所有化学物理性质（在ChemSpider网站上报告并获得(http://www.chemspider.com（化学蜘蛛网）/).

进行了所有统计分析

使用R v3.3.2（R Foundation for

统计计算，奥地利维也纳）

and Minitab 19 (https://www.minitab.com/en-us/) and https://software.broadinstitute.org/morpheus/.

3.结果和讨论

图2中报告的热图说明了在30和43°C下使用常规和Vac-HS-SPME在不同提取时间（10、20、30和40分钟）对12种目标化合物进行采样时，其轮廓的总体变化。将这两个热图分别归一化，以强调在单个测试温度内响应的变化。

可以观察到，Vac-HS-SPME采样增加了总体轮廓（颜色变为红色）。然而，需要对挥发性最高和最低的化合物进行重要区分。对于前者，一般来说，在30和43°C下，常规和Vac-HS-SPME之间可以观察到相同的性能，而在43°C时，萃取率甚至稍低。这些化合物的动力学通常很快；因此，当这些分析物达到“平衡”时，使用减压条件的效果是有限的，甚至是不存在的。使用Vac-HS-SPME在43°C下的信号轻微降低表明，温度对早期洗脱化合物的影响与使用真空获得的萃取收率的增益相当。这种行为可能与萃取动力学的加速（在测试的萃取时间范围内无法评估）和竞争效应有关。有趣的是，对于其余化合物，真空和温度的影响反而是协同作用的，显著提高了更早取样时间的萃取效率，事实上，对于最新的化合物（V6-V12），使用Vac-HS-SPME 20分钟后在43°C下获得的响应强度几乎相同，意味着几乎达到了平衡；而在常规条件下，响应比Vac-HS-SPME低得多，并且从10分钟上升到40分钟。

值得注意的是α-法尼烯（V12）的改进，据报道，这是鉴别外病毒橄榄油地理来源的重要标志[21,22]。当采用Vac-HS-SPME取样和较高温度时，观察到几乎10倍的增量。图3显示了在43°C下采样10分钟时常规和Vac-HS-SPME之间的色谱痕量比较。

需要强调的是，提高水基溶液的Vac-HS-SPME温度的效果并不总是成功的，尤其是对于吸收性SPME纤维[11]。事实上，顶空湿度的增加增加了小瓶中的压力，从而降低了其效益。在食用油样品中，如橄榄油，不存在水（或存在微量水）；因此，尽管必须注意避免伪影的形成和热降解产物，但可以利用加热产生有益的效果。此外，在橄榄油等高粘度样品中，温度升高会降低流体的粘度。橄榄油的高粘度值（30°C时为49 mPa，比水大60倍）增加了液相电阻，“延迟”了分析物通过橄榄油基质液体边界层的扩散。无论使用何种压力条件，当靶向与顶空亲和力较小的分析物时，这种现象都非常重要[16]。事实上，对于这些分析物，会发生一个多阶段的过程：每次顶空浓度低于平衡水平时，分析物分子都会从液体样品转移到气相[14,16]。这个“补充”过程取决于液相中的阻力（与粘度有关）。此处显示，将样品从30°C加热到43°C会导致样品粘度降低40%（即~30 mPa s），从而提高液相扩散率，从而提高总萃取率。由于Vac-HS-SPME采样对萃取动力学有显著影响，因此这种“补充”过程比常规HS-SPME更具局限性。然而，使用更温和的温度（43°C）和减压可协同提高总萃取率。。

双变量CCD：响应面研究

To better characterise the gain in performance obtained using Vac-HS-SPME over regular, a full factorial central composite design (CCD) was used to optimise at the same time and temperature ranges both the regular and Vac-HS-SPME. Based on previous findings that highlighted that time and temperature were the main significant variables [19,20], a two-variable (k=2; temperature and time) CCD was applied. The extraction temperature was tested over a range of 30 (minimum temperature settable in the autosampler) and 55°C, and the extraction time was set between 10 and 30 min.

在指纹和轮廓分析研究中，目标是最大化整体响应，最大化检测到的峰值数量及其强度。考虑到检测到的所有峰的累积面积强度，建立了响应面（图4）。从图4可以明显看出，使用Vac-HS-SPME在较温和的温度和较短的时间内达到最大值，而使用常规HS-SPME时，即使在55°C和提取30分钟后也没有达到最大值。使用Vac-HS-SPME，检测到的峰总数从~150增加到~180。

结论

与常规HS-SPME相比，使用Vac-HS-SPME的优势得到了展示和讨论。加热样品（43°C，而不是30°C）进一步提高了真空的好处。此外，对于粘性液体样品，温度仍然是一个重要参数，因为它增加了通过液相的扩散率，促进了界面处的传质。

将Vac-HS-SPME用于橄榄油的非针对性研究，可以显著提高可获得信息的水平以及应用模式识别算法进行交叉样本比较的有效性，从而为质量和真实性研究提供更有效的标记识别。