Anal Chem：小鼠早期肝纤维化的快速荧光诊断方法

1引言

纤维化是肝脏对损伤的一种典型反应。它会使肝细胞受损，导致肝脏功能紊乱，最终发展为肝硬化、肝细胞癌和肝衰竭等肝脏性疾病，甚至引发死亡。早期肝纤维化无任何临床症状，发现时往往已发展到肝硬化，且治疗过程复杂、昂贵，严重者甚至涉及肝移植。迄今为止，尚无有效的抗纤维化治疗方案。多项临床研究表明，早期肝纤维化的优化治疗方式可以有效防止其进一步的发展及恶化，使肝纤维化完全逆转。因此，早期诊断肝脏纤维化对其及时进行干预治疗，逆转纤维化过程，阻断肝硬化的形成，保护肝脏功能具有重要意义。单胺氧化酶B（MAO-B）是一种黄素酶依赖型酶，可以将氨类的底物催化氧化成相应的亚胺，随后水解成为醛类化合物，其主要催化底物是苄胺和苯乙胺。有研究表明MAO-B不仅与神经性疾病密切相关，也参与胶原纤维的形成，其活性在早期肝脏纤维化病人血清中较正常人显著升高，所以被认为是一个肝脏纤维化理想的生物标志物。因此，开发合适的手段对MAO-B进行活体内的原位监测，将有助于肝脏纤维化的早期诊断，也能为深入了解MAO-B在肝脏纤维化过程中的重要作用提供研究工具。

双光子荧光成像技术由于其高灵敏度、低光毒性和自荧光干扰而被广泛应用于体内生物活性分子的原位分析。由这种方法产生的荧光具有较强的组织穿透能力，因此可以用其检测组织深处的某种生物活性分子含量。在过去的十年中，一些具有良好灵敏度和选择性的荧光方法也被用于MAO-B的成像，但它们的反应速率较慢，不利于体内MAO-B的实时可视化。

2课题设计

基于上述问题和研究进展，近日山东师范大学唐波教授团队开发了一种能够快速监测体内MAO-B含量的双光子检测探针，将其命名为BiPhAA。BiPhAA结构简单，容易制备，是在苯胺的邻位通过Suzuki偶联反应引入MAO-B的特异性底物苯乙氨而构建。苄胺部分可以被MAO-B特异性催化氧化为醛基。然后，醛基与相邻苯环上的氨基反应形成碳氮双键。这产生了更大的BiPhAA共轭系统，从而产生了明亮的荧光。（图1）

图1（上）荧光探针BiPhAA结构及反应机理；（下）BiPhAA的合成路线示意图，以2-氨基苯硼酸的Suzuki偶联反应为基础

3研究结果

在制备完成BiPhAA后，团队对其光物理性质进行了深入研究。通过对其荧光光谱的扫描，可以看到，BiPhAA可以被MAO-B激活，荧光在10 min时达到最大强度，在无MAO-B加入的时候，在490 nm/520 nm处则具有较弱的荧光。其浓度依赖性也比较低，在2 ng/μL时就能产生非常高的荧光强度，且随着MAO-B浓度的增加而逐渐增加。这些结果均表明它能够快速识别MAO-B，且该反应具有高选择性、高灵敏度及高生物兼容性等优点。（图2）

图2 （a）BiPhAA在MAO-B存在与否状态下的吸收/发射光谱；（b）BiPhAA与MAO-B反应的荧光生成动力学；（c）BiPhAA与MAO-B反应程度随浓度增大而变化

随后，该团队评估了BiPhAA追踪活细胞中MAO-B的能力。在确认了BiPhAA不具有明显的细胞毒性后，将其与肝细胞HL-7702孵育15 min。如图3所示，经BiPhAA孵育的细胞发出明亮的荧光。而用MAO-B特异性抑制药物D-青霉胺（D-pen）处理后，绿色通道的荧光强度明显降低，表明BiPhAA可被细胞内MAO-B激活。经MAO-B酶活性检测试剂盒检测，发现D-pen处理的细胞提取液中MAO-B活性低于对照组，这与细胞中荧光的变化一致，进一步证明以上结论。

图3 （a）空白对照组；（b）实验组，即添加了BiPhAA的细胞；（c）添加了D-pen抑制剂组的荧光实时图像；（d）为量化结果；（e）为MAO-B酶活性检测试剂盒检测抑制剂组结果

在证实了BiPhAA检测细胞中MAO-B的能力之后，该团队又研究了它是否能在体内监测MAO-B的浓度波动情况。在体外的肝星状细胞LX-2经过缺氧处理会产生纤维化，进而使MAO-B水平升高，因此以缺氧培养的LX-2细胞作为实验组与未经处理的LX-2细胞做对照。如图4所示，D-pen组细胞中荧光低于对照组。而细胞通过无氧条件培养激活，发现荧光信号显著提高。再次经D-pen处理后，荧光减弱。以上成像结果表明BiPhAA可以实时监测细胞中MAO-B活性变化。

图4 （a）空白对照组，仅细胞；（b）添加了BiPhAA的常氧孵育细胞组；（c）添加了D-pen抑制剂组；（d）乏氧状态下培养的细胞组，添加了BiPhAA；（e）乏氧状态下培养的细胞组，添加了BiPhAA和D-pen抑制剂；（f）为上图的量化情况

最后，该团队检测了BiPhAA在肝脏纤维化小鼠体内原位示踪MAO-B的能力，是否能通过其荧光变化诊断早期肝纤维化小鼠。首先，通过腹腔注射四氯化碳的橄榄油溶液建立小鼠肝纤维化模型。随后，该团队使用双光子显微镜，尾椎静脉注射BiPhAA之后立即对小鼠肝脏组织进行了实时荧光成像。如图5所示，肝脏纤维化的小鼠体内显示出极强的荧光信号，这个信号是正常小鼠的六倍，表示肝脏纤维化的小鼠体内MAO-B的过表达现象。

图5 （a）正常小鼠和（b）肝纤维化小鼠的体内三维图像，均经过了200μM的BiPhAA处理；（c）为前两图的量化

4总结

总而言之，该团队设计了一种新型双光子荧光探针BiPhAA，该探针具有合成简单、光稳定性好、背景荧光低、选择性高等优点。更重要的是，探针可以快速、准确地对MAO-B进行检测。所以，BiPhAA非常适用于活体内MAO-B的实时原位成像。使用探针，在活体水平上对MAO-B进行实时原位成像，结果发现MAO-B水平在肝纤维化小鼠体内明显上升，并且可以将肝纤维化小鼠从正常小鼠中识别出来。该工作为早期肝纤维化的诊断提供了一种高灵敏度的荧光成像材料，并有望实现商品化。同时，BiPhAA也有望为肝脏纤维化的分子机制研究提供理想的工具。

原文链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.1c00815

DOI：10.1021/acs.analchem.1c00815