大麻类化合物轮廓的梯度HPLC-UV方法

全球大麻行业发展迅速，许多国家和美国各州为医疗和娱乐大麻项目增加了监管框架[1,2]。在这个新兴市场中，质量控制是保护消费者健康和安全的重要组成部分，对大麻测试实验室的需求越来越大，需要对多种大麻素以及杀虫剂、真菌毒素、重金属等潜在污染物进行分析测定。目前关于效力的法规因管辖区而异，但通常需要测试四氢大麻酚（THC）和大麻二酚（CBD）的活性形式。此外，许多国家还需要对酸的形式、四氢大麻酚酸（THCA）和大麻二酚酸（CBDA）以及其他大麻酚类化合物进行测试，如大麻酚（CBG）、大麻烯酸（CBGA）、四氢大麻素（THCV）、大麻色素（CBC）、大麻环醇（CBL）和大麻酚（CB N）。随着法规的发展，以及对次要大麻素研究兴趣的扩大，重要的是要有能够满足这些需求的稳健分析方法。

历史上，气相色谱/质谱（GC/MS）用于大麻分析中大麻素和其他感兴趣化合物的分离和定量。然而，对于GC，必须注意避免在加热注射过程中酸性物质脱羧。高压液相色谱（HPLC）方法允许分析员避开许多样品制备和衍生步骤，并已成为大麻效力分析的首选方法[3,4,5]。一般来说，所有HPLC方法开发的方法都着眼于平衡几个元素，其中包括分析的最终目标、目标化合物的分辨率和潜在干扰、速度和分析稳健性。

根据电荷、极性和其他功能性评估感兴趣的分子后，色谱方法开发人员将重点放在色谱柱和溶剂选择、pH条件、缓冲液选择和浓度、温度等方面。具体方法可能因分离的主要目标而异。例如，如果需要对复杂样品进行综合表征，则可以接受以牺牲分析时间为代价来最大化整体分离的方法。另一方面，如果只需要特定关键对的分辨率，则速度和选择性（对于关键对）可能是主要重点。考虑到这些问题，我们着手开发一种高效液相色谱法，能够在最短的时间内完全分解17种大麻素。此外，还探索了提高特定临界对THC异构体（Δ8-THC和Δ9-THC）分辨率的第二个目标。

从Cerilliant（Round Rock，TX，USA）处获得了17种分析参考大麻素标准品（1 mg/mL），并将其在53:47甲醇：乙腈中合成，最终成分浓度约为59µg/mL。该混合物由Δ8-四氢大麻酚（Δ8-THC）、Δ9-四氢大麻素（Δ9-THC，大麻酚酸（CBNA）、外四氢大麻酚（exo-THC）、四氢大麻酸A（THCA-A）、四氢大麻酚素（THCV）和四氢大麻烯酸（THCVA）。这些大麻素的分子结构如图1所示。

使用Evoke C18，15 cm x 4.6 mm柱，填充来自Regis Technologies，Inc（美国伊利诺伊州莫顿格罗夫）的3µm全多孔颗粒，在岛津Nexera（日本京都）进行色谱方法开发。使用不同的有机改性剂（甲醇和乙腈）在等容和梯度操作模式下筛选反相条件。还对酸添加剂（甲酸和三氟乙酸）进行了研究，发现它们对实现羧基化物种（例如CBCA、CBDA等）的良好峰形很重要。表1列出了产生最基线分辨峰并作为进一步方法开发基础的条件。

Figure 2a shows the baseline-subtracted chromatogram for the separation of the 17 cannabinoid test mixture using the conditions listed in Table 1. Baseline resolution is achieved for each of the component peaks with the exceptions of CBGA and CBG (Rs = 1.40), THCVA and CBN (Rs = 1.42), and the coelution of Δ8-THC and CBNA at 8.20 minutes. In an effort to improve the resolution of these pairs, the effect of adding ammonium formate, the ammonium salt of formic acid, to mobile phase A in concentrations ranging between 5 and 10 mM was investigated. The addition of ammonium formate to formic acid mobile phases increases the ionic strength as well as slightly raises the pH [6,7]. With 0.1% formic acid and ammonium formate concentrations of 0 mM, 5 mM, and 10 mM, the pH values of mobile phase A were measured to be 2.7, 3.1, and 3.5, respectively.

如图2所示，将甲酸铵添加到流动相A中会减少羧基化大麻素的保留，而脱羧基物种则不受影响，因此基线重溶CBGA/CBG和THCVA/CBN。使用5 mM甲酸铵，CBNA的保留时间移动到7.63分钟，并与合成Δ9-THC时形成的杂质exo-THC（图2b）进行共稀释。通过将浓度增加到10 mM甲酸铵，CBNA的保留进一步改变，使其比THC异构体更早洗脱，但THCA-A转变为与CBC共溶（图2c）。研究发现，7.5 mM甲酸铵的中等浓度可以提供测试混合物中所有17种大麻素的基线分辨率（图2d）。表2显示了当流动相A中甲酸铵缓冲液的浓度变化时，酸性大麻素的保留时间如何变化。

进一步研究了缓冲液浓度和pH值之间的相互作用，以及羧基化物之一CBNA的保留时间。表3概述了这些条件。在前三种情况下，用0.1%甲酸和浓度为0 mM、5 mM和10 mM的甲酸铵制备流动相A。未调整的pH值分别为2.7、3.1和3.5。如上所述，随着缓冲液浓度的增加（8.31分钟、7.76分钟和7.34分钟），CBNA的保留率降低。在第四种情况下，在流动相A中使用10 mM甲酸铵，在流动相A或B中均未使用甲酸。在这些条件下，将CBNA电离，其保留时间减少至1.64分钟。在第五种情况下，使用10 mM甲酸铵，并用甲酸将pH值调节至3.1，以匹配用0.1%甲酸和5 mM甲酸铵盐制备的流动相a的pH值，CBNA的保留时间为7.36分钟。在最后一种情况下，将10 mM甲酸铵调节至pH值2.8，保留时间为7.52分钟。因此，可以看出，羧基化、可离子化大麻素的保留是洗脱强度、pH值（和分析物的相应质子化状态）和缓冲液浓度/离子强度的复杂函数。

需要注意的是，由于甲酸铵仅添加到流动相的水组分中，因此总离子强度在梯度运行期间发生变化。例如，当以表1中列出的梯度使用流动相A中的7.5 mM甲酸铵时，在15分钟的运行过程中，柱上的总浓度从1.875 mM变化到0.75 mM。然而，经过大约5分钟的重新平衡，发现连续运行的结果是可重复的。对于真实世界的样品，例如植物提取物，基质效应可能会引起关注。尽管此处未确定，但梯度法可能允许在75-90%MPB梯度之前在较弱的溶剂中建立一定的灵活性，以清除基质干扰。分析家还必须评估其他内源性大麻化合物，如萜烯和萜类化合物，是否可能干扰大麻素的鉴定。

在某些分析中，分析员关心提高某些关键对的分辨率。在一种成分比另一种成分丰富得多的情况下，这可能尤其如此。在图2所示的梯度分离中，Δ9-THC和Δ8-THC之间的分辨率约为1.50。这些异构体是中性的，其保留率在很大程度上不受流动相pH值或离子强度变化的影响。通常，可以通过运行等容分析和降低洗脱液强度来提高分辨率。在Δ9-THC和Δ8-THC的情况下，通过改变不同乙腈和甲醇比例的流动相B的组成，可以观察到最大的影响。

乙腈和甲醇是反相高效液相色谱中最常用的两种有机改性剂，许多研究详细说明了它们提供的不同且通常是互补的选择性。对溶质-流动相、溶质-静止相和固定相-流动相分子相互作用的基本理解可以为HPLC方法开发中使用的策略提供信息[8]。例如，已经注意到，根据所使用的改性剂以及它如何分配或吸附到固定相中，可以观察到疏水性、氢键和偶极型相互作用的差异[9,10]。在开发方法和选择合适的流动相时，可以参考Snyder的溶剂选择性三角形，该三角形根据溶剂的酸性、碱性和偶极性绘制溶剂图[11,12,13]。具有其中一个特性的溶剂比其他两个特性的更显著，可以很容易地从图中识别出来。例如，甲醇具有酸性，而乙腈具有偶极性。由于它们是可混溶的，因此可以以任何比例混合，以获得中间或新的溶剂性质。

Figure 3 plots the effect of varying the percentage and composition of mobile phase B (MPB) on the isocratic resolution of 1:2 Δ9-THC:Δ8-THC using the same Evoke C18, 15 cm x 4.6 mm column. Consider the analysis when performed with H2O/MPB = 10/90. The resolution of Δ9-THC and Δ8-THC is 1.06 when MPB = 100% acetonitrile. When MPB = 100% methanol, the resolution is 2.84. Maximum resolution (Rs = 3.12) is observed when MPB = 15:85 acetonitrile:methanol. That relatively minor improvement in resolution afforded by the blended MPB might suggest pure methanol to be the preferred organic modifier for this analysis, especially given the convenience of using a single solvent over pre-mixing a blend of acetonitrile:methanol or investing in alternative pumping instrumentation (e.g. quaternary pumps). With complex samples, though, care must be taken to observe how a desired change in selectivity can affect other analytes in the separation.

A brief example serves to illustrate that several parameters should be considered when developing a chromatographic method for the resolution of complex samples involving key critical pairs. Consider again the separation of 1:2 Δ9-THC:Δ8-THC in the presence of cannabicyclol (CBL). In Figure 3 it can be seen that the resolution of the THC isomers is superior with pure methanol than with pure acetonitrile as the organic modifier. As shown in Figure 4, though, if CBL is present, it coelutes with Δ8-THC in H2O/methanol = 10/90. CBL elutes well away from the critical pair if pure acetonitrile is used, but the THC isomers are insufficiently resolved (Rs = 1.06). A 50:50 blend of acetonitrile:methanol provides good resolution, with Rs > 2.5 for both pairs. So, while binary mobile phase systems are very common in reversed-phase HPLC separations, ternary mobile phases can provide access to unique selectivities based on the combination of acidic, basic, and dipolar properties of the mobile phases used.

综上所述，我们开发了一种高效液相色谱法，通过使用改变有机和酸性调节剂浓度的筛选操作，完全分解17种大麻素，并为进一步开发奠定了基础。将甲酸铵添加到流动相A中，可以改变羧基化物种相对于中性物种的保留量，并且优化的浓度允许测试混合物中所有大麻素的基线分辨率。此外，使用三元流动相系统（水、甲醇、乙腈）可以提高THC异构体的分辨率，同时允许灵活性以避免潜在干扰。