Nature: 继Science后，细胞色素P450酶催化研究再登Nature封面！

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美国密歇根大学的Alison R. H. Narayan教授课题组使用细胞色素P450酶通过氧化C-C键形成进行生物催化交叉偶联的策略，展示了使用天然P450催化剂在一组酚醛底物上催化交叉偶联反应的能力。团队成员设计了一种P450，能够将低产率、非选择性反应转化为高效和选择性的过程，使其具有所需的反应性、位点选择性和Atropo选择性。这种构建空间位阻联芳键的简化方法为组装具有催化剂控制的反应性和选择性的分子提供了一个可编程平台。

该研究成果以“Biocatalytic oxidative cross-coupling reactions for biaryl bond formation”为题，发表在世界顶级综合性学术期刊Nature上，并被选为封面文章。

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https://doi.org/10.1038/s41586-021-03707-9

前言导读

联芳基化合物具有两个相连的芳环，广泛存在于医学、材料科学和不对称催化反应中。最常用的构建这些分子的策略依赖于预官能化芳基片段的金属催化交叉耦合，尽管代价是在合成过程中增加额外的步骤，但提供了预编程的位点选择性。

这些反应可能需要进行广泛的筛选，以确定每一对新的耦合对的合适条件，并且仍然局限于容易接近的连接性，而四邻位取代的联芳基键的形成仍然是一个突出的挑战。氧化偶联为双芳基键的形成提供了另一种策略，通过将两个C-H键转化为C-C 键。然而，这些优点是以转化的效率和选择性为代价的，而这种转化通常取决于每种基底的内在空间和电子性质，从而限制了这种转化的多功能性。

目前，许多金属催化剂和无金属氧化剂已被报道用于酚醛底物的二聚和交叉偶联。然而，这些方法的应用通常仅限于富电子酚类，而与缺电子酚类的氧化偶联仍然具有更广泛的挑战性。生物催化氧化交叉偶联反应有可能通过提供具有催化剂控制选择性的范例来克服小分子介导的直接氧化偶联方法固有的局限性。

研究内容

联芳基键普遍存在于不对称催化的药物、材料和配体中(图1a)。目前，常用金属催化的预功能化芳基片段的交叉耦合来构建这些分子，从而提供预先编程的位点选择性(图1b)。通过两个C-H键转变为一个C-C键的氧化偶联为联芳基的形成提供了一种新的策略(图1b)。

然而，这种转变以牺牲效率和选择性为代价，由每个底物的立体解结构和电子特性所决定，这限制了这种转换的通用性(图1c)。目前，自然界已经进化出了氧化酶，包括漆酶和细胞色素P450，它们可以在在联芳基天然产物的生物合成中介导酚类化合物的二聚化。

此外，这类催化剂存在于大量相关酶的序列中，具有催化多种氧化偶联反应的潜力。漆酶在选择性催化中的应用受到这些酶发挥作用的实例的稀缺性的限制控制初始氧化后键形成的选择性。相比之下，不断扩大的P450库介导高选择性氧化反应，其中存在一小部分催化位点选择性和抗阻选择性二聚化的酶。（图1d）

图1 联芳基通过直接氧化交叉偶联形成

从自然二聚反应转向非自然的交叉偶联化学反应如图2所示(图2a)。研究结果表明，与酶活性位点结合两个非等效酚底物可以克服小分子介导的氧化交叉偶联反应中传统的空间和电子限制。研究人员将香豆素4和16添加到产生KtnC酶的培养液中，形成非自然交叉偶联产物。使用这种 KtnC 催化的交叉偶联反应策略，用一组香豆素底物观察到底物混杂(图2b)。

大多数交叉偶联反应保持了自然二聚反应中所表现出的位选择性和苯基选择性（图2 c)。除了形成一系列不对称的双香豆素产品外，研究人员还测试了一组更多样化的酚醛基板作为香豆素4的交叉偶联剂(图2d)。正常来说，与天然底物4相似的酚类底物具有优越的反应性能。然而，随着底物结构与天然香豆素支架的分离，交叉偶联活性和位点选择性显著降低。因此，研究人员认为，蛋白质工程可以克服其在底物范围、化学选择性、位点选择性和atropo选择性等方面的局限性。

图2 野生型P450 KtnC催化氧化交叉偶联反应的范围

再者，研究团队认为，成功设计交叉偶联催化剂(LxC)可将低产率、非选择性的生物催化反应转化为一种实用的合成方法。由于野生型KtnC的反应活性和位点选择性较低，因此选择香豆素10和2-萘酚(31)的交叉偶联作为目标反应(图3a)。在高通量酵母生物转化中筛选变异体，通过Rapid Fire质谱分析总交叉偶联产物的形成，然后使用液相色谱-质谱联用法在二级筛选种分析含有较高水平交叉偶联产物的反应混合物的交叉偶联位点的选择性(图3 b)。

最终，这种Rapid Fire质谱筛选能够快速识别具有提高目标交叉偶联反应活性和位点选择性的变体。通过迭代的定向进化，逐步提高交叉耦合反应的总活性和位点选择性(图3c)。团队通过五轮进化，设计了一种活性提高了92倍的生物催化剂，但由于对变体进行了工程改造，增加了交叉偶联产率和位点选择性，而反应的对映选择性则发生了降低。为了恢复催化剂对atropo选择性的控制，使用RapidFire和手性LC-MS的组合进行了另外两轮工程（图3d）。

图3 工程P450生物催化剂提高活性和选择性

在使用蛋白质工程策略的同时，替代野生型酶可以为氧化交叉偶联反应提供补充催化剂。采用生物信息学指导的方法，可视化已知介导分子间氧化二聚反应的P450周围的自然序列空间。已知P450可使酚基质二聚，而单独聚集的特征化酶通常转化不同的底物。

在此基础上，对23种酶的反应性进行了筛选，其中包括20种未经鉴定的酶，以及3种已表征的 P450，这些 P450 已知可将具有结构上不同于香豆素4的萘醌和萘底物二聚化（图4a）。这些酶可以有效地催化与萘酚的氧化交叉偶联反应，为KtnC提供一个互补的催化剂。人工融合酶是通过将P450RhF还原酶域(RhFRed)固定在每个P450的羧基末端来设计的，以重建催化活性所需的电子传递。

研究团队在使用 P450-RhFRed 文库进行的一系列大肠杆菌裂解物筛选中，发现交叉偶联产物以 1:1 的比例通过多种酚类底物与萘酚配对物形成，具有令人惊讶的混杂性（图 4b）。这些结果证明了不同 P450 催化剂可实现的互补反应性，并提供了对不同联芳基支架的生物催化途径。

图4 探索具有互补反应性的催化剂的替代序列空间

结论与展望

Alison R. H. Narayan教授团队所提出的生物催化方法通过超越空间和电子限制并重新定义可以有效交叉偶联的底物，克服了反应性障碍。此外，使用大分子配体提供了在联芳基偶联反应中实现催化剂控制的位点选择性和对映选择性的机会。大量可用的天然催化剂，以及已证明的根据所需底物范围、反应性和选择性调整酶的能力，使这种生物催化方法成为联芳基分子聚合组装的有力工具。