金属敏感分析物超性能液相色谱分离的更快结果

摘要-许多高效液相色谱的从业人员认为，分析速度只取决于进行分离所需的时间。然而，当在HPLC仪器和色谱柱中分离与金属表面相互作用的分析物时，分析速度可能会受到调节所需时间的负面影响。对于重要类别的分析物，如寡核苷酸、酸性肽和阴离子极性代谢物，情况就是这样。在最近的一项进展中，开发了一种创新技术来缓解与HPLC系统和色谱柱的金属成分的相互作用，减少了获得金属敏感分析物准确、可重复结果所需的时间。

介绍

Analytical scientists are constantly under pressure to produce results quickly. In seeking out more efficient ways to accomplish their tasks, separation scientists look at all aspects of their instrumentation and methods. In 2004, the introduction of Ultra-Performance Liquid Chromatography (UPLC™) improved the speed with which analytical scientists could carry out LC separations [1 - 3]. The combination of columns packed with < 2 μm particles and low-dispersion high-pressure tolerant instrumentation greatly reduced separation times.

然而，对于某些应用，在获得准确和可重复的结果之前，由于需要对液相色谱系统和色谱柱进行大量调节，分析时间受到了负面影响。需要调节的根本原因之一是某些分析物与HPLC系统和色谱柱的金属表面之间的相互作用。众所周知，不锈钢硬件可能会导致一些分析物的峰形较差和回收率低[4-7]。表现出这种行为的化合物通常含有磷酸和/或羧酸基团，尽管一些具有其他富电子官能团的分析物已被报告显示出类似的问题[4]。研究发现，吸附的严重性随着分析物中这些官能团的数量增加而增加[6,7]。当不锈钢被腐蚀时，吸附变得特别困难[8]，这可能是由于暴露在高酸性和/或含有氯盐的流动相中[9]。

缓解这些问题的一种方法是使用替代金属，例如钛或镍钴合金（例如MP35N）作为HPLC系统流道中的组分[10]。虽然这些替代品表现出更好的耐腐蚀性，使其适用于需要高盐浓度流动相的应用，但它们仍然可以吸附某些分析物[11]。为了完全避免金属表面，在HPLC系统和色谱柱中使用了聚醚醚酮（PEEK）等有机聚合物。然而，这种工程塑料缺乏承受UPLC压力（≥5000 psi）所需的机械强度，除非用钢包覆。此外，PEEK与一些溶剂不兼容，尤其是四氢呋喃、二甲基亚砜、氯仿和二氯甲烷[12]。PEEK也相对疏水，可能需要通过多次进样调节PEEK表面，以减轻疏水吸附[13，14]。

为了应对不受欢迎的表面吸附带来的挑战，一系列名为MaxPeak的新技术™ 最近开发了高性能表面（HPS）。在MaxPeak HPS家族中，亲水表面可减轻塑料瓶和96孔板上的疏水吸附[15]。在此，我们描述了第二种MaxPeak HPS化学，其设计目的是提供屏障，以缓解分析物与LC系统和柱中金属表面的不希望的相互作用（见图1）[16]。本文所述工作中使用的表面化学基于与乙烯桥杂化（BEH）类似的杂化有机/无机成分™) 颗粒[17]，非常适合反相和亲水相互作用色谱。在这里，我们证明了该技术降低了对调节的需求，这使得分离科学家能够更快地获得金属敏感分析物的准确和可重复的结果。

实验

所有UPLC和MS仪器、色谱柱和数据系统均来自Waters Corp.（美国马萨诸塞州米尔福德）。采用MaxPeak HPS技术的色谱柱和仪器可从Waters Corp.购买，并带有PREMIER™ 品牌名称。

UPLC H级仪器配备了四元溶剂管理器、直通式针头样品管理器、CH-a柱加热器和光电二极管阵列（PDA）检测器，用于分离一磷酸腺苷（AMP）和三磷酸腺苷。使用标准仪器和采用MaxPeak HPS技术的仪器。AMP和ATP以二钠盐的形式从Millipore-Sigma（美国马萨诸塞州伯灵顿）获得。每天在100%水中新鲜制备的样品含有50μg/mL的AMP和ATP，并将0.4μL注入UPLC BEH C18 1.7µm、2.1 x 50 mm的柱中。此外，还使用相同尺寸、含有相同填料但采用MaxPeak HPS技术的色谱柱进行分离。所有试验均使用新柱进行。在30°C下，使用10 mM醋酸铵水溶液（pH 6.8）流动相，以0.5 mL/min的流速进行等容分离。使用Empower记录260 nm处的紫外响应™ 3色谱数据系统。

寡核苷酸分离是使用H类生物系统和配备5μL钛流动池的PDA检测器进行的。UPLC系统使用500 pmol的39米寡核苷酸进行调节。样品为MassPREPTM寡核苷酸标准品（Waters Corp.，Milford，MA，USA），在200μL去离子水中重新配制（每个寡核苷酸的浓度为5 pmol/μL），将2μL注入UPLC寡核苷酸BEH C18 1.7µm，2.1 x 50 mm色谱柱。为了进行比较，还使用相同尺寸和包含相同填料的色谱柱进行分离，但采用了MaxPeak HPS技术。在60°C下进行梯度分离，流动相A在水中含有25 mM乙酸己铵（pH 6.0），流动相B在水中含有50/50（v/v）流动相A/乙腈。在流速为0.4 mL/min的条件下，在12 min内进行50-86%B的线性梯度。使用Empower 3色谱数据系统记录260 nm处的UV响应。

对于肽分离，带有QDa的UPLC H类二元Bio PLUS系统™ 使用了质量检测器和Empower 3色谱数据系统。实验使用标准仪器和采用MaxPeak HPS技术的仪器进行。样品为mAb色氨酸消化标准品（Waters Corp，Milford，MA），在含有0.1%甲酸、浓度为0.5 mg/mL的MS级水中重新配制，并将10μL注入UPLC肽CSH™ C18 1.7µm，2.1 x 100 mm色谱柱。为了进行比较，还使用相同尺寸、含有相同填料但采用MaxPeak HPS技术的色谱柱进行分离。在60°C下进行梯度分离，流动相A在水中含有0.1%甲酸，流动相B在乙腈中含有0.1%乙酸。在52分钟内以0.2 mL/min的流速进行1-35%B的线性梯度。QDa质量检测器在正离子电喷雾模式下运行，采集范围为250-1250 m/z，毛细管电压为1.5 kV，锥电压为10 V，探针温度为600°C。使用代表[M3H]3电荷状态的m/z值849.2进行选择离子监测，以监测T37肽。

结果和讨论

MaxPeak HPS技术的优点可用于分离核苷酸，已证明核苷酸可吸附在不锈钢表面[5-8]。三磷酸腺苷（ATP）（化学结构见图2）是一种核苷酸，它除了是DNA和RNA的前体外，还是一种重要的代谢物，为许多细胞过程提供能量[18]。因此，ATP的量化在许多不同的应用领域中都很重要。图3所示为一系列色谱图，展示了使用标准与MaxPeak HPS系统和色谱柱分离一磷酸腺苷（AMP）和ATP。在每个病例中，进行了15次连续注射。在使用标准体系和色谱柱获得的色谱图中，AMP的峰显示出明显的拖尾，随着进样次数的增加，拖尾逐渐减少。ATP因其三个磷酸基团而吸附力更强，显示出严重的拖尾现象和极低的强度，在第十五次注射中几乎检测不到。当使用相同的标准系统和采用MaxPeak HPS技术的色谱柱时，AMP峰显示出更好的对称性。然而，ATP峰值严重尾随，在一系列注射中有所改善，但在第十五次注射中仍显示出严重尾随和低强度。相比之下，当同时使用包含MaxPeak HPS技术的系统和色谱柱时，色谱图显示从第一次进样到最后一次进样的对称峰。

在图4中，我们显示了系统和色谱柱三种组合的AMP和ATP峰面积与注射数的关系。很明显，除了使用标准系统和/或色谱柱时观察到的峰拖尾外，峰面积也低于使用包含MaxPeak HPS技术的系统和色谱柱时观测到的峰面积。这对ATP尤其如此，因为它在不锈钢表面上具有很强的吸附性。因此，如果没有比本实验中使用的更多的条件，使用标准体系和色谱柱获得的定量结果将无法反映样品中ATP的真实含量。此外，由于峰面积随注入次数的变化而变化，精度也会受到影响。相反，当使用包含MaxPeak HPS技术的系统和色谱柱时，从第一次注入时观察到一致的峰面积。

研究发现，MaxPeak HPS技术对寡核苷酸的分离特别有价值[19]，寡核苷酸在许多重要用途中都很重要，包括作为疫苗[20]、治疗学[21]和诊断学，例如作为聚合酶链反应（PCR）的引物[22]。LC和LC/MS方法对于这些模式的质量控制非常重要[23]。图5显示了UPLC系统和柱中金属表面对分离寡核苷酸混合物的影响的示例。样品中含有脱氧胸腺嘧啶（化学结构见图2）与15、20、25、30和35个核苷酸的混合物，这些核苷酸使用标准UPLC柱或采用MaxPeak HPS技术的UPLC柱进行分离。在两个色谱柱上连续注射三次。使用标准柱，首次注射时观察到低峰高，随后注射时峰高逐渐增加。因此，对于标准柱，在获得可重复的结果之前，需要进行多次调节注射。然而，即使在广泛的调节之后，精确的量化也可能具有挑战性，因为调节的影响往往是短暂的[19]。相反，采用MaxPeak HPS技术的色谱柱为所有三次进样提供了可重复的峰高。这表明在使用MaxPeak HPS技术时，对调理的需求减少了。

得益于MaxPeak HPS技术的另一类重要分析物是酸性肽，即在中性pH下呈现净负电荷的肽[24]。例如，在蛋白质的酶处理中可能会出现这种肽。蛋白水解消化物的分离是用于表征治疗性蛋白质（如单克隆抗体）特性的基本工具。当与质谱联用时，这些肽图提供了氨基酸序列的信息，以及相关杂质（如脱酰胺物种）的存在。人源化单克隆抗体胰蛋白酶消化液中存在的一个重要酸性肽的例子是位于Fc恒定区的T37肽，它与基于单克隆抗体的药物产品的治疗效果有关[25]。该肽含有四个酸性氨基酸残基和一个碱性氨基酸（见图6A），因此在较大的pH值范围内带负电。当使用酸性低离子强度流动相的标准体系和色谱柱时，该流动相最适合LC/MS（水和含有0.1%甲酸的乙腈），观察到T37峰有明显的拖尾，掩盖了小拖尾峰的存在（见图6B）。相比之下，使用包含MaxPeak HPS技术的系统和色谱柱，T37峰尖锐且对称，可以准确量化拖尾峰。这些小峰来自脱酰胺变体，它们相对于主T37峰的面积受到监测，以控制治疗性单克隆抗体的质量[25]。

为了在使用传统金属表面技术时减少T37肽峰的拖尾，UPLC系统通过用30%磷酸溶液冲洗20分钟，然后用水冲洗，直到pH值为中性来调节。这可以暂时减少T37峰的拖尾，但拖尾因子在暴露于0.1%甲酸流动相48小时后增加，表明表面吸附活性增加。如图7所示。相比之下，使用MaxPeak HPS技术，在磷酸洗涤和不磷酸洗涤的情况下都获得了类似的结果，在相同的时间段内进行分离时，从头到尾都观察到了一致的分析性能。同样重要的是，当使用包含MaxPeak HPS技术的系统和色谱柱时，拖尾因子较低，从而实现脱酰胺变体的极好分辨率，从而能够准确和重复地量化它们。

结论

这些结果表明了传统UPLC系统和柱中分析物与金属表面的相互作用所带来的挑战。使用耗时的调节方法缓解这些相互作用可能会增加分析时间，并且不能保证获得准确和可重复的结果。利用包含MaxPeak HPS技术的系统和色谱柱提供的新功能，现在可以在无需广泛调节协议的情况下分离金属敏感分析物，从而在更短的时间内提供准确和可重复的结果。如本文所示，该技术对一系列分析物类别很重要，包括酸性极性代谢物、寡核苷酸和酸性肽。其他含有磷酸和/或羧酸基团的分析物显示出类似的益处[16]，一些含有额外富电子官能团的化合物也是如此。因此，这项技术可能有利于一系列应用。