先进的有效聚糖分析

研究人员越来越关注一类至关重要的生物分子：聚糖。尽管与其他生命的主要组成部分（蛋白质、脂类和核酸）相比，研究较少，但复杂多样的聚糖对生命是必不可少的，从古生菌到人类，它们无处不在[1]。糖科学的最新进展为聚糖及其在生物结构中作为关键代谢、结构和物理成分的作用提供了新的线索。糖化工程在治疗性抗体开发中的潜力已经确立，也许是最重要的。

本文概述了聚糖在临床上发挥的作用、聚糖分析面临的挑战，总结了可用于阐明其复杂结构的工具，并提供了将传统LC-MS工作流程与新兴的高分辨率离子迁移率（HRIM）光谱技术进行比较的数据。

糖、糖工程和药物开发

随着糖生物学知识的扩展，聚糖在生命科学许多分支[2]中的功能的巨大重要性正在被阐明，包括肿瘤学[3]、免疫学[4]和传染病[5]等重要领域。此外，聚糖分析的发展与控制特定生物分子糖基化的能力增强相吻合。被称为糖工程的这一过程涉及操纵糖基化模式，要么通过特定糖基转移酶的遗传调节，要么通过生物合成后糖共轭物的化学操纵[6]。

糖基化的差异已被证明在许多方面影响治疗性单克隆抗体（mAb）的活性[7,8]。作为一个关键例子，从Fc结构域聚糖中减少或消除岩藻糖单糖（也称为去糖基化）已被反复证明可增加抗体依赖性细胞毒性（ADCC）。脱岩藻糖基抗体构建物导致自然杀伤（NK）和其他免疫细胞的更高活化。这反过来会导致治疗性单克隆抗体结合的ADCC增加，包括癌细胞[12,13]。Genentech（美国加利福尼亚州南旧金山）应用此战略开发Gazyva（obinutuzumab），以接替其

价值70亿美元的巨无霸CD20-靶向单抗Rituxan（rituximab）。接受Gazyva治疗的患者与接受Rituxan治疗的患者相比，缓解深度更大，无进展生存率更高[9]。

此外，患者的糖基化变化可能与治疗结果相关。为了优化治疗和临床试验结果（例如患者分层），具有以高通量方式识别糖基化特征的能力至关重要。

关于疫苗开发，聚糖的临床影响的另一个例子包括HIV-1包膜蛋白，该包膜蛋白富含聚糖结构，有助于病毒逃避免疫系统的识别。这种所谓的“聚糖屏蔽”是一个活跃的研究领域，是疫苗开发和广泛中和抗体生产的潜在目标[10]。同样，新冠肺炎大流行也引起了人们对SARS-CoV-2尖峰蛋白糖基化在整个病毒感染和治疗发展中所起作用的关注[11,12]。在广泛中和HIV抗体研究的基础上[13]，研究人员现在也在寻求对冠状病毒应用类似的方法[14]。

聚糖分析的挑战

为了利用糖工程的潜力和对糖基化模式的深入了解，研究人员越来越感兴趣的是利用更好的工具和方法来快速准确地测定聚糖结构。然而，尽管取得了令人瞩目的进展，聚糖分析仍然具有挑战性，主要是由于聚糖本身的性质。

可以说，主要的结构挑战是聚糖是结构最多样的生物分子家族之一[2]。虽然大多数哺乳动物的聚糖由大约九个单糖单元构成，但这些单体可以通过许多不同的糖苷键相互连接，包括以分支方式连接[15]。此外，聚糖可能从一种单糖到多种。总的来说，可能的聚糖结构数量随着每个额外单体和支链的增加而迅速增加。据估计，对于一种六糖，总共约有1012种可能的聚糖结构，尽管它们可能并非都在自然界中出现[16]。

此外，聚糖组装不像DNA、RNA和蛋白质生物合成那样是模板驱动的。相反，聚糖是通过作用于内质网和高尔基体的糖基转移酶的交错网络生成的。因此，在相同的糖基化位置可能会出现不同的聚糖结构，生成的生物分子除了所携带的聚糖（即糖形体）外都是相同的。随着糖基转移酶表达的变化，给定糖共轭物的糖型分布也会发生变化。

重要的是，构成聚糖的许多单糖是彼此的异构体，例如葡萄糖、半乳糖和甘露糖。这意味着许多不同的聚糖结构可以具有相同的质量、电荷和物理性质，但在功能和识别方面差异很大。这些复杂异构体材料的分离和鉴定可能非常耗时且资源密集。

聚糖分析工作流的状态

如上所述，聚糖结构具有固有的复杂性和异质性。聚糖分析的go-to技术长期以来一直是质谱法（MS），它提供了阐明从生物材料中分离出来的特定聚糖结构和糖类所需的分辨率和灵敏度[17,18]。然而，为了在同一样品中高度相似的聚糖之间实现有意义的分离，需要在MS分析之前使用分离技术。

在实际水平上，与许多聚糖一样，高度相似的生物分子的液相色谱分离通常需要延长运行时间，这在分析工作流程中造成了潜在的瓶颈。即使长时间运行，一些聚糖的行为如此相似，以至于无法避免LC共溶剂化，这会使完整的结构赋值复杂化甚至无法实现[19]。

因此，虽然LC-MS仍然是聚糖分析的标准工作流程，但迫切需要更快的技术和更好的分辨率。

最近，基于无损离子操纵结构（SLIM）的高分辨率离子迁移率质谱（HRIM-MS）已成为聚糖分析中一种很有前景的分离策略[20]。与液相色谱法不同，MOBILion的HRIM系统在气相中分离电离分子。该系统使用印刷电路板（PCB），如图1所示，放置在保持恒定压力（2-4托）的腔室中。印刷电路板上印有一系列射频（RF）、直流（DC）和行波电极，这些电极提供了一个离子管道，分析物沿着一条异常长的蛇形路径穿过该管道。推动离子的电场还可以防止离子在运动时撞击表面，从而防止其途中的任何损失。根据行波的速度，离子要么“冲浪”，要么不被分离，要么与气体分子发生足够的碰撞，使其翻过行波峰值，然后发生分离。

在HRIM中，与其他离子迁移技术一样，离子的迁移时间取决于其质量电荷比及其大小和形状。As离子沿分离路径被驱动；与惰性缓冲气体的碰撞使它们减速到与其大小成比例的程度。离子分离路径的长度对于获得具有挑战性结构多样性的聚糖的足够分辨率所需的高分离度至关重要。MOBILion的第一款HRIM产品的离子路径为13米（42英尺）。印刷电路板独特的蛇形通道设计允许13米离子通道装入公文包大小的设备中，从而实现无与伦比的异构体结构分离。

HRIM设置很简单，因为它发生在几乎理想条件下的气相。无需像液相色谱那样优化色谱柱、流速或液体成分。此外，HRIM通过毫秒到秒的数据采集实现快速分离。关于最先进的HRIM方法是如何通过扩展路径长度来提高分辨率的，已经有很多报道[21]，并且当与MS结合时（HRIM-MS，图2），在生物医学和临床研究中，为聚糖的无缝分离以及结构测定提供了巨大的潜力[22,23]。

HRIM-MS实践

美国佐治亚州雅典市佐治亚大学复合碳水化合物研究中心（CCRC）最近的工作证明了HRIM-MS的性能。实验将这一新一代离子迁移技术与优化的LC-MS协议进行了比较[24]。

CCRC的实验装置使用MOBILion HRIM仪器与安捷伦6545四极飞行时间（Q-ToF）耦合。通过180分钟反相纳米流LC-MS/MS分析从胎球蛋白和RNaseB释放的过甲基化N-聚糖，这是传统LC-N-聚糖分析工作流程的典型特征。使用HRIM-MS分析相同的聚糖种类。在2分钟内，使用180分钟液相色谱分离法鉴定的所有聚糖均使用HRIM-MS工作流程进行分离和鉴定。这节省了90倍的时间，例如，可以将三个月的LC分析压缩为一天的分析。此外，HRIM-MS分析解析了无法用LC解析的双天线二烷基复合聚糖的结构异构体（图3B、G5）。

能够快速运行数百个样品，可以建立聚糖异质性的“正常范围”。这一优势使我们能够在与生物制药快速发展相适应的时间框架内，更深入地了解聚糖在各种疾病中的行为。

展望未来

糖基分析或糖组学，科学家在其中阐明生物分子的特定糖基化模式，已成为生物医学研究、药物开发和生物制药质量控制的一个重要方面。与传统方法相比，HRIM在易用性、一种方法对多个分析物类别的通用性、分辨率和分析速度方面都有优势。这些属性使研究人员能够处理聚糖结构的复杂性及其在时间尺度上的异质性，从而实现高通量分析。这里讨论的HRIM分析比LC分析快近100倍，但这只是开始。更快速的采样——这是一个正在发展的主题——可以将分析时间提高更多数量级。