0.5 ppb食用油中多环芳烃（PAHs）的分析

多核芳香烃（PAHs）存在于许多食用油中，通常在精炼和制造过程中引入，但也可能是运输和储存过程中环境污染的结果。其中一些化合物已知为致癌物，因此对其进行测试对于保护公众健康至关重要。欧洲联盟（欧盟）最近对所有食品（包括食用油）引入了新的指令，要求三种多环芳烃（包括苯并（a）蒽、chrysene和苯并（b）荧蒽）的最高含量为0.9 ppb，此外，苯并（a-芘）的最初靶点本身还不足以作为毒性标记。因此，本研究将研究一种方法的开发，包括使用气相色谱（GC）和单四极杆质谱仪（MS）对棕榈油进行样品净化，以达到0.5 ppb的报告限值。

欧盟食品中多环芳烃测量法规

1970年，美国环保局提议对环境监测样品中常见的16种多环芳烃进行监测。欧洲联盟（EU）与现在隶属于欧洲食品安全局（EFSA）的食品科学委员会（SCF）一道，根据各国际食品研究小组进行的评估，进一步完善了该清单，这些研究小组根据健康风险而非食品中的发生情况优先考虑化合物。因此，它提出了一个较短的清单，包括八种高分子量化合物，但根据对食品中多环芳烃毒性的评估和对小鼠的致癌性研究，建议使用苯并[a]芘作为重要标记物。他们还强调了继续收集其他多环芳烃数据的重要性，以评估食品材料的污染和多环芳烃分布的任何可能变化。这些指令于2006年出台，一直实施到2011年，当时欧盟（EU）针对所有食品（包括食用油）引入了新的指令，要求三种额外多环芳烃的最高含量为0.9 ppb，再加上苯并（a）芘的原始目标。最终在2015年，欧盟更新了这些法规，并增加了一系列天然食品[1]。这些法规的实施时间表摘要如下：

•2006年：以苯并（a）芘为标记物的第1881/2006号法规（EC）[2]。

•2011年：第835/2011号法规（EU）对该法规进行了更新，将苯并（a）蒽、chrysene和苯并（b）荧蒽添加到苯并（a）芘的原始目标中，而苯并（1）芘本身并不是一个足够的毒性标记[3]。

•2015年：欧盟发布了第2015/1933号法规（EU），规定了可可纤维、香蕉片、食品补充剂、干草药和干香料中多环芳烃的最高含量[4]。

分析方法学

仪表

本研究使用了PerkinElmer-Clarus 680气相色谱仪（GC）[5]和SQ8单四极杆质谱仪[6]，利用TurboMass™ 仪器控制、数据处理和报告用色谱数据系统（CDS）[7]。GC还配置了一个分体式/无分体式程控温度汽化器（PTV）注入口，稍后将对其进行说明[8]。

样品制备

从油中去除和提取多环芳烃是本分析的一个重要组成部分，可最大限度地提高多环芳烃的回收率，并最大限度地减少提取物中干扰化合物的存在。考虑了多种提取方法，包括凝胶渗透色谱（GPC）、固相萃取（SPE）和分子印迹聚合物（MIP）滤筒。这三种方法的提取性能都相似，但之所以选择MIP方法，是因为与其他提取方法相比，MIP方法更易于使用。MIP技术的基本原理如下所述。

分子印迹聚合物

这种提取技术使用一种工艺，通过该工艺，选定的功能单体可以围绕模板分子自组装，然后在交联分子的存在下聚合[9]。这些滤筒设计用于保留感兴趣的化合物并去除样品基质，在本例中为棕榈油。首先用溶剂冲洗滤筒。然后将样品装入或放置到药筒中。对于此方法，使用50:50的棕榈油溶液：环己烷。然后用20 mL体积的环己烷或足够的体积冲洗滤筒，以洗脱材料中的油。环己烷的作用是使多环芳烃留在MIP中，同时将棕榈油从滤筒中除去。在成功去除尽可能多的油后，使用2 mL乙酸乙酯去除药筒中的多环芳烃。提取协议如下所述。

提取协议

在装载样品之前，用5 mL环己烷冲洗滤筒。准确称量约1g样品，并用1mL环己烷稀释。然后将其装入滤筒，然后用环己烷冲洗，这样可以使多环芳烃滞留在MIP中并清除油。用环己烷冲洗后，用2 mL乙酸乙酯从滤筒中洗脱多环芳烃。为了优化检测限，可以通过蒸发已知体积的溶剂将多环芳烃浓缩在提取物中。最终体积取决于检测限要求；然而，在这种情况下，保留了1毫升提取物。

浓缩在一个罩中进行，缓慢的氮气吹扫进入小瓶。流量取决于同时浓缩的样品数量。应避免溶剂起泡，因此正确的流量由氮气流在溶剂中形成的小酒窝表示。

大容量注射

本研究采用大容量注射（LVI）来提高检测限[10]。使用温度可编程分流/无分流进样口（PSS），也称为程序化温度汽化（PTV）来浓缩进样口中的分析物。从入口吹扫溶剂后，分体式通风口关闭，进样口迅速加热，使分析物挥发，从而不分体式进样。PSS注射器的优点是它是“通用”的，这意味着它能够使用小体积和大体积进行热挥发（分离/不分离）、程序升温挥发（分离或不分离）以及柱上和溶剂清洗。PSS也具有较低的热质量，因此其加热和冷却非常迅速。冷却风扇和散热片有助于散热，以便在GC恢复到初始温度时做好注入准备。PSS喷油器如图1所示，采用柱上（非分体式/无分体式）配置，可以每分钟200°C的速度加热至最高500°C。

受控波动

执行LVI所需的注入技术称为溶剂清洗注入，因为溶剂是从注射器中清除的。在吹扫期间，喷油器端口保持在非常低的温度，主要有两个原因。首先，如果注入器端口很热，溶剂会发生巨大的蒸汽膨胀。其次，在溶剂清洗后关闭分体式通风口以优化检测限值之前，半挥发性成分不会挥发。

与热进样口闪蒸挥发的局限性相比，受控挥发有很多优点，概述如下：

•快速热注入可能导致溶剂蒸汽膨胀，超过衬里的体积。当样品压力太大，污染了气动和管道时，这有时被称为反闪。

•即使样品没有进入气动系统，样品也不包含在衬里中，因此无法进入色谱柱，这可能会导致精度差和回收率低，尤其是高沸点化合物。

•热注入可能导致热不稳定化合物分解，这通常归因于快速样品汽化所需的高入口温度。

•热注射可能会导致注射器分馏，其中较轻的成分首先蒸发，然后迅速离开注射器针头，而较重的化合物需要更长的时间蒸发，并以较慢的速度离开注射器，从而导致样品歧视。

还必须强调的是，溶剂清洗是一种不分次注射技术，用于为半挥发性化合物提供较低的检测限。因此，由于这种可控的挥发过程，溶剂清洗比传统的无分流注射提高了回收率和重复性。此外，控制挥发可用于经典的分体式和无分体式注射，无需在注射后快速倾斜注射器进行溶剂净化。由于蒸汽膨胀大大减少，因此可以使用更大的体积。

实验

在70°C的入口温度和150 mL/min的分流下，溶剂清洗时间为0.5分钟。使用5 uL注射液。

在关闭开口后，以200°C/min的速度将喷油器加热至最终温度330°C。

在尺寸为30 m x 0.25 mm x 0.25µm的PerkinElmer Elite 5固定相柱上进行色谱分析。初始GC烘箱温度设置为70°C，保持时间为2分钟。然后以5°C/min的速度将其升温至最终温度300°C，并保持2分钟。

如前所述，欧盟法规的最新版本要求报告四种多环芳烃苯并（a）蒽、chrysene、苯并（b）荧蒽和苯并（α）芘。最初，MS采集是在同时进行全质量扫描和单离子监测（SIM）模式下进行的。采集全扫描以确保样品中的油被成功清除，而为了校准和定量，采集SIM时使用质量228 amu的苯并（a）蒽和chrysene，以及质量252 amu的苯并芘和荧蒽。在浓度为2 ppb时进行重复性（精密度），而在浓度为5 ppb时，进行基质加标以确定回收率。

校准

使用从Restek Corporation购买的标准混合物（目录号31011[11]）进行五点内标线性回归校准，其中含有16种多环芳烃。然而，只研究了四种感兴趣的化合物。使用氘化chrysene-d12作为内标物，在乙酸乙酯和环己烷的50:50混合物中稀释标准物。注：“零点”未包括在校准中，且该线未强制通过零点。

讨论和结果

前面描述的Elite-5相固定相色谱柱通常用于分析半挥发性化合物，包括多环芳烃。四种被调查多环芳烃的质量色谱图如图2所示。附加峰是16 PAH标准混合物中的异构体，但本研究不需要。

图3举例说明了在全扫描模式下进行的注射，以确保净化后的样品基质不会干扰分析。在减少样品干扰和优化仪器正常运行时间方面，研究了许多其他清理程序，以评估最稳健的方法，但这些程序不在本研究范围内。

分析性能如表1所示，包括校准结果、根据每种化合物的定量SIM离子测定的信噪比以及重复性实验的结果，其中从同一小瓶中进行五次2.0 ppb标准品注射。

在审查信噪比时，作者认为报告限值在稳健的定量范围内，可以再降低10倍。此外，棕榈油的5 ppb基质峰值结果均在可接受的回收范围内。

结论

本次调查的结果明显达到了欧盟的监管限制。因此，该方法目前是许多食品组织的首选技术，这些组织要求报告一套四种多环芳烃，以超过欧盟0.9 ppb的要求。此外，数据表明，该方法可以轻松实现对更大系列多环芳烃化合物的检测能力，检测能力降至0.05 ppb。这项工作将是未来研究更多多环芳烃和食品报告下限的基础。