选择性和稳健的UHPLC-MS/MS测定食品中丙烯酰胺含量

摘要

丙烯酰胺于2002年首次在食品中被发现[1,2]，因其被归类为可能致癌物而引起广泛警报[3]。到2017年，监管机构建立了基准水平，并建议公司继续监测并尽量减少热加工食品中的丙烯酰胺水平。此后，对丙烯酰胺检测的可靠和准确方法的需求不断增加。由于丙烯酰胺的高度极性、需要大量样品清理以及结果普遍缺乏可靠性，使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的传统方法面临着众多挑战。本文提出了一种改进的丙烯酰胺检测方法，该方法采用了一种新的两步萃取法。该方法具有较好的选择性、良好的回收率和较高的信噪比，可用于监测多种食品中的丙烯酰胺水平。

介绍

2002年在食品中发现的微量丙烯酰胺[1,2]由于潜在的健康风险引起了人们的直接关注。甚至在它在食品中被发现之前，丙烯酰胺的毒理学效应就已经有报道了。丙烯酰胺被认为是一种神经毒素、生殖毒素和诱变剂[3]。富含碳水化合物和热加工食品中氨基酸和还原糖之间的美拉德反应[4]是导致这些食品中产生较高浓度丙烯酰胺的原因。

经过2007年至2011年的广泛接触评估和筛选，美国食品和药物管理局（FDA）[5]和欧洲食品安全局[6]设定了各种食品中丙烯酰胺的指示值，并建议公司监测丙烯酰胺水平，并采取措施降低其水平。2017年，确立了薯条、薯片、咖啡、婴儿食品和饼干等食品的基准水平[7]。继续调查可能会在未来制定更严格的法规，以保障消费者健康。

开发一种稳健的分析方法，能够准确可靠地检测和量化丙烯酰胺水平，这对于食品行业来说非常重要，可以确保测试符合规定，并且食品对公众消费是安全的。

丙烯酰胺作为分析物的性质给其测量带来了许多挑战。丙烯酰胺极性很强，因此使用反相色谱技术很难保留，并且由于它缺乏发色团，因此不可能使用常规的UV检测方法。添加化学衍生步骤可以启用UV检测或增加亲脂性，使反相色谱法适用，但使协议耗时。在MS分离过程中，相同质量的其他小极性化合物可能会引起特异性问题以及离子抑制。

除此之外，不正确的样品制备步骤或每次注入后未能清洁色谱柱都可能导致色谱柱结垢，显著降低色谱柱的使用寿命，并影响色谱峰的形状。例如，对薯片等脂肪基质的样品清理不当可能会导致脂质进入最终样品。

本文提出了一种改进的方法，用于准确定量三种不同食物基质（即薯片、咖啡和婴儿食品）中丙烯酰胺的含量。采用了一种新颖的两步提取工艺。第一步是通过使用二氯甲烷（DCM）溶解和分离脂肪和亲脂化合物。第二步，涉及支持液体萃取（SLE），对提取物进行提炼和浓缩。在发展了这种方法后，它被用于测定烧焦面包中的丙烯酰胺水平。

材料和方法

样品制备和两步提取

称取1 g±0.05 g磨碎的薯片、磨碎的咖啡或均质婴儿食品，放入15 mL Thermo Scientific Nunc试管中。食品基质用丙烯酰胺校准标准物（10μL）和稳定标记的丙烯酰胺-d3内标物（10微升）进行强化。溶解标准溶液的溶剂蒸发30分钟，留下丙烯酰胺残留物。然后添加10 mL水，并将试管置于水平平板振动器上30分钟。然后添加2 mL二氯甲烷，将试管放回振动筛上10分钟，然后在3500×g下离心15分钟。

然后将200μL等分顶部水相添加到SLE 96孔板（200 mg（pH 9）/2 mL）（HyperSep SLE，Thermo Scientific）的适当孔中，并允许吸收15分钟。当重力不足时，有时需要一个小的真空脉冲将样品拉入平板。用2×750μL乙酸乙酯/四氢呋喃（50/50，v/v）将化合物洗脱到含有20μL乙二醇的2 mL 96 well板中。施加真空脉冲，使板完全干燥，并在40°C的N2下蒸发约1小时。最后，向每个孔中额外添加200μL水，加盖并旋涡，然后在3500×g下离心15分钟。

分析分离

超高效液相色谱（UHPLC）系统（Thermo Scientific™ 征服地平线™) 使用以下溶剂进行分离：水/甲酸（100/0.5，v/v）作为流动相A，甲醇作为流动相B。流速保持在0.5 mL/min，线性梯度曲线显示瞬时变化，如表1所示。总运行时间为4.5分钟。HPLC柱（Thermo Scientific™ 超碳水化合物™ 由于其新颖的选择性和保留高度极性物种的能力，使用了HPLC柱（100×2.1 mm，5μm）。使用主动预热和静止空气模式将温度维持在60°C。

检测和数据分析

对于MS/MS，三级四极质谱仪（Thermo Scientific™ TSQ Endura公司™) 使用表2中列出的参数。用于设置感兴趣分析物丙烯酰胺和内标物丙烯酰胺-d3的选定反应监测（SRM）转变的m/z值如表2所示。使用色谱数据系统软件（Thermo Scientific™ 变色龙™ 色谱数据系统（CDS）软件版本7.2.10）。

结果和讨论

丙烯酰胺的线性回归校正模型

校准模型被评估为具有1/x2权重的线性回归（图1）。在水/乙二醇（90/10，v/v）中新鲜制备了8个100-5000 ng/g范围内的校准标准品。由于预计在许多基质中的LLOQ上方会发现丙烯酰胺，因此目的是一次性测定多种食品中丙烯酰胺的浓度，因此使用了非跟踪校准线。每天计算每个基质的绝对回收率。

重复之间的准确度和精密度

已知样品的测量准确度和精密度增加了未知浓度的可靠性。为了确定准确度和精密度，在校准范围内对所有三种食品基质在四种浓度下的六个不同重复的质量控制（QC）样品进行了测试。QCs被评估为三种食物类型中每一种的非提取样品和提取物。对于食品质量控制，丙烯酰胺的平均浓度由每种食品类型的三个空白样品测定。将三个空白样品中测得的平均浓度与标称浓度相加，得出每个食品基质的新理论QC浓度。

表3显示了未采集样品以及三种食品样品的准确度和精密度数据。

The nominal concentrations were 100 ng/g LLOQ, 250 ng/g low QC, 800 ng/g medium QC, and 4000 ng/g high QC. Intra-batch accuracy and precision was acceptable for all three matrices with bias being <13% and CV <5% at each of the four QC levels in both non-extracted and extracted food QCs, demonstrating that the assay is accurate and precise at the concentrations measured when results are read off a non-extracted calibration line. A representative potato crisp chromatogram at the low QC level is presented in Figure 2.

图2：磨碎的薯片中低质量控制的色谱图示例。

检测特异性

由于预计每个食物来源中都会出现可测量的丙烯酰胺浓度，因此只能检查内标的工作浓度是否由于同位素杂质而对丙烯酰胺通道没有贡献。对在水/乙二醇（90/10，v/v）中制备的一个双空白样品（未添加丙烯酰胺或内标）和在水/聚乙二醇（90/10，v/v）中制得的一个单空白样品（仅添加内标）进行色谱分析。

证明了丙烯酰胺和丙烯酰胺-d3的特异性，因为在空白样品中未检测到干扰峰。单个空白样品的代表性色谱图如图3所示。

无分析结转

残留可能是由于UHPLC系统清洁不良或之前注射后仍粘附在色谱柱上的分析物的“记忆效应”造成的。在注入最高校准样品后，通过注入两个双空白样品来评估该系统的携带。将空白样品中分析物和内标物的面积响应与之后未拖曳LLOQ样品的面积响应进行比较。如图4所示，使用Vanquish Horizon UHPLC系统时未出现结转。

基质效应和萃取效率的评估

对于复杂的矩阵，如食品和饮料分析中遇到的矩阵，强烈建议使用合适的内部标准。在对样品进行任何操作之前，应添加内部标准，以便在样品转移和回收过程中修正小体积差异。

由于这里使用的内标物也有稳定的标记，它有效地补偿了MS/MS分析过程中的潜在离子抑制或增强。

由于所测试的每种食物类型中都含有丙烯酰胺，因此不可能像通常情况那样将基质效应和回收实验分开。绝对回收率（基质效应和回收率的组合）是通过比较六个低质量控制复制品中内标物的平均峰面积来计算的，对于三种食物基质来源中的每一种，与非牵引质量控制中的内标峰面积进行比较。考虑到双空白食品基质中的内标转换没有可见峰，这种方法是有效的。此外，由于使用了稳定标记的丙烯酰胺，它在整个提取过程和UHPLC-MS/MS分析过程中具有相同的性质。下表4显示了三种食物的绝对回收率。无论食物基质如何，总回收率和抑制率均小于20%。

烤面包中丙烯酰胺含量的测定

一旦使用三种食物基质对丙烯酰胺定量分析方法进行了可靠性测试，然后将其应用于测定烧焦的棕色和白色吐司中的丙烯酰胺浓度。众所周知，富含碳水化合物的食物在过度加热时会形成丙烯酰胺，所以烤面包被烧焦到可以食用的程度。然后将整片磨成细粉。每个样品中的三个重复样品经过相同的样品制备程序，然后进行UHPLC-MS/MS分析。

结果表明，烧焦的棕色吐司中的丙烯酰胺浓度是烧焦的白色吐司中丙烯酰胺浓度的两倍（表5）。重复样品显示出最小的变化，这表明制备的样品是同质的，并且该方法具有高度的重复性。

结论

简单而稳健的两阶段提取和清理程序显著提高了丙烯酰胺分析质量，使其在重复试验中可重复，并导致较高的回收率和无基质效应。表6概述了分析中使用的参数。

表6：采用两步样品提取工艺的丙烯酰胺分析总结。

选择一个对极性分析物具有较高保留容量的合适色谱柱，可获得可接受的保留，并对丙烯酰胺具有更好的选择性。使用当前参数的4.5分钟运行时间比以前的协议有了显著改进，运行时间约为11分钟，使测试速度更快，从而支持高吞吐量项目。

与早期的丙烯酰胺分析方法相比，两步萃取结合有机冲洗可防止色谱柱污染。由于本方案的改进，获得了更高的信噪比，从而使注入量降至1μL，进一步降低了塔和系统污染的可能性。更新后的方案适用于测量一系列食品中的丙烯酰胺。