埃因霍芬理工大学AM：可用封装细胞的超分子水凝胶

近日埃因霍芬理工大学生物医学材料与化学系教授PatriciaY.W.Dankers 以“Engineering the Dynamics of Cell Adhesion Cuesin Supramolecular Hydrogels for Facile Control over Cell Encapsulation and Behavior”为题在advanced materials上发表文章。

01【研究背景】

天然细胞外基质（ECM）是一种类似水凝胶的纤维网络，它是由小分子和大分子之间的定向相互作用进而自组装形成瞬态超分子纤维。这种瞬态过程表现出各种生物物理和化学信号，以调节细胞行为，故在组织生长和再生等过程中发挥着重要作用。

因此，大量的研究工作致力于开发合成水凝胶，该合成凝胶可作为ECM代替物用于3D培养细胞和类器官。这类合成材料必须是生物相容的，并结合生物活性信号来调控细胞行为。

最近，基于非共价或动态共价的水凝胶作为合成ECM替代物越来越受青睐。超分子水凝胶是一种动态的水凝胶，通过定向、非共价相互作用由分子模块组装而成。这种非共价相互作用的可逆性使水凝胶具有强的适应性。这种适应性允许水凝胶内进行细胞扩散和迁移，与传统水凝胶相反不需要降解和大孔径。

各种类型的天然或合成聚合物，如透明质酸和聚（乙二醇）（PEG），已经用互补或自互补的超分子基进行了修饰。这些超分子基通过诸如主客体或氢键等相互作用形成分子间和分子内交联，这使3D互连凝胶网络具有足够高的交联密度。

超分子材料的组装过程、结构形态和整体性质不仅取决于超分子相互作用的类型，还取决于超分子结构单元的共价框架的分子设计。对于具有二价（B）或单价（M）四重氢键形成的超分子水凝胶，作者之前观察到在很大程度上粘弹性取决于分子组成的比率。最近，作者发现M型和B型分子在组装的超分子纤维内外的交换动力学可以通过改变它们的比例来调节。

在由离子或主客体交联形成的动态水凝胶中，最近的研究结果突出生物信号（如刚度和应力松弛）对细胞活动和凋亡起着关键作用。然而，在具有生物化学信号的动态水凝胶功能化过程中，已经观察到相互矛盾的结果。

虽然发现整合素结合精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）配体可以增强某些动态水凝胶系统中的细胞扩散，其他体系已被证明该策略不适用。迄今为止，决定具有生物化学信号的动态水凝胶有效功能化的关键因素尚不清楚。

02【全文速览】

作者研究了分子交换动力学对超分子水凝胶中生物活性基的影响。为此，使用含有脲基嘧啶酮（UPy）基团的B型和M型分子作为超分子结构单元。UPy基团通过四重氢键二聚化，在氯仿中，结合常数和寿命分别为6×107 M-1和1 s。

在水中，这些氢键需要被屏蔽。该设计中，这是通过引入烷基间隔基来实现的，在将UPy-二聚体组装成一维堆叠时形成疏水区，通过侧链尿素基团的氢键进一步稳定（图1）。进一步的组装通过将堆叠成纤维。通过改变该系统中B型和M型单体之间的比例，来调节了组装纤维中的分子交换动力学，由此产生水凝胶。

交换动力学被认为是决定细胞结合基功能化有效性的重要因素。因此，基于B型和M型UPy分子的非凝胶形成机制用于配制多组分超分子水凝胶系统作为合成ECM，用于细胞、球体和类器官的3D封装和培养。

图1.超分子的构建及自组装成纤维

作者设计了两种类型的超分子模块来构建超分子水凝胶（图1 a）。作为B型结构单元（即UPy-PEG-UPy），一条分子量为10 kDa的PEG链被两个UPy部分封端。作为M型结构单元（即UPy-G），分子量为528 Da的低聚（乙二醇）（OEG）链在一端被UPy部分封端，在其末端是甘氨酸-酰胺基团，另一端，甘氨酸-酰胺基团包含在此设计中，作为先前报道的M型分子中使用的甲氧基端基的仿生替代品。

在这种情况下，外周甘氨酸-酰胺基团会靠近细胞，而OEG则不会暴露，从而可能最大限度地减少乙二醇的非污染特性的生物后果。最后，合成了两种M型分子变体，分别含有磺化花青染料（UPy-Cy5）或环状RGD（UPy-cRGD）端基，分别作为荧光或细胞粘附超分子添加剂。

03

【机理研究】

图2. 不同比例的超分子结构单元配制而成的水凝胶

由于组装纤维的缠结和捆绑，增加溶液中构建模块的浓度，可导致形成水凝胶网络。本文以5 wt%的固定总浓度改变了构建模块之间的比例，以研究共组装的效果。

在下文中，作者将样品表示为BZMW，其中Z和W分别表示每种组合物中B型和M型分子的重量百分比。作者对流变学研究表明，在较低M/B比下形成的水凝胶表现出更多的弹性响应，更少刚性（较低的储能模量[G']值），并显示出非固体的行为（图2b，c）。

类似的行为在具有甲氧端基的M型分子中观察到，并且可以归因于更高动态性的B型分子破坏了较低动态性的M型分子堆叠的玻璃化，在图1b中观察到的这种较短的纤维。通过应力松弛实验研究了M/B比对凝胶网络动态行为的影响。实验结果表明，可以通过改变M/B比来改变水凝胶中的网络的动力学和应力松弛机制。

为了阐明凝胶网络的动态特性是否也在分子水平上发生了改变，作者通过光脱色荧光恢复技术（FRAP），在水凝胶组分中加入可追踪的M型荧光添加剂UPy-Cy5（图2f）。通过FRAP实验表明，比较了共组装后的M型分子与B型分子，发现分子交换动力学发生了巨大变化，其M型分子堆积无序导致交换动力学增强。

图3.不同成分水凝胶的细胞粘附和扩散

作者研究了细胞在接触不同水凝胶组成时的粘附和扩散。具体来说，细胞粘附和扩散是指导各种细胞功能的基本性质，并且可以阐明在不同生物医学领域的潜在的适用性。

为此，作者将不同组成的水凝胶中加入3mM型粘附配体UPy-cRGD，并研究了在水凝胶表面培养的血管衍生基质产生肌成纤维细胞的粘附和形态。结果表明，在掺入UPy-cRGD分子后，动态动态的水凝胶不会变得具有细胞粘附性，强调了分子动力学对水凝胶中粘附配体有效结合的重要性。

图4.水凝胶的浓度依赖性行为

作者研究了聚合物总含量对水凝胶性能的影响，方法是在固定的M/B比例下，在2.5-10%wt%范围内改变聚合物浓度。改变聚合物浓度会改变水凝胶的存储模量（图4a），而水凝胶的网络和分子动力学没有受到很大影响（图4b,c）。所有水凝胶都显示出高度的细胞粘附和扩散（图4d-g）。

当聚合物浓度增加到10%（即B1M9）时，细胞数量和扩散轻微下降，这可能是由于该浓度固有的较高PEG含量。高度亲水的PEG链具有防污性能，此前已被用于制作超分子生物材料的非细胞粘合剂。因此，在超分子水凝胶中，长链PEG可通过潜在屏蔽具有生物活性的RGD细胞粘附配体来影响细胞行为。

因此，有必要澄清PEG含量在不同组成的水凝胶上观察到的细胞粘附和扩散差异中的作用可能。理想情况下，用相似长度的PEG间隔物设计B和M型分子，可以完全排除PEG含量在体系中的作用可能。

图5．超分子水凝胶中的细胞封装和扩散

3D封装细胞是ECM水凝胶材料潜在应用。值得注意的是，作者发现M型UPy-G分子自身不能形成水凝胶，而B型UPy-PEG-UPy分子在< 1 wt%的低浓度下也不会形成水凝胶（图5a,b）。这种独特的组合使该系统中B型和M型分子的非凝胶形成机制成为可能，以开发一种混合诱导凝胶化方法，用于在生理pH值和温度下将细胞封装在水凝胶内。

在该策略中，细胞被包含在B型纤维的分散体中，凝胶形成是在混合两种分散体时开始的，一种由M型分子组成，另一种由B型分子组成（图5a，b）。混合两种成分后，配制过程在15分钟内产生稳定的水凝胶。按照这种方法，在有或没有UPy-cRGD添加剂存在下，HVSC被封装在2.5 wt%（B0.25M2.25）和5wt%（B0.5M4.5）水凝胶中。应该指出的是，这种混合诱导凝胶化方法主要适用于具有高M/B比的组合物，因为较高浓度的B型分子可以在生理pH值下自成凝胶，防止B型和M型组分在分散状态下必要的混合。

图6. 超分子水凝胶封装的多细胞球体

球体和类器官是多细胞3D结构，与单细胞相比，它们与自然组织的生物学相似性更高，因此越来越多地用于再生医学和疾病研究。尽管细胞-细胞相互作用在3D细胞结构中起主要作用，但细胞-基质相互作用也会高度影响它们的行为，例如生长和分化。

因此，作者研究了超分子水凝胶，以调控多细胞球体的行为。我们假设将粘附配体有效地掺入超分子水凝胶，可以通过改变水凝胶-球体界面处的细胞-基质相互作用来调控球体的行为。此外，这些实验旨在确定降低动态水凝胶组分是否仍表现出足够适应性以允许细胞活动，例如在3D空间中的细胞迁移。为了测试这一点，形成了HVSC和CMPC球体，并将它们封装在有或没有UPy-cRGD添加剂的B0.25M2.25水凝胶中。

引人注目的是，封装后1天内，当UPy-cRGD分子加入凝胶组分时，HVSCs开始从球形向水凝胶基质迁移（图6a）。7天后，两种球形细胞向基质迁移显著，在第14天，含有UPy-cRGD组的细胞向基质迁移进一步增强（图6a-c）。相反，在培养期间，当水凝胶中不含UPy-cRGD时，没有检测到HVSC迁移，CMPC球体轻微收缩。重要的是，在有或没有UPy-cRGD添加剂的水凝胶中培养14天后，大多数细胞仍能存活于两种球形细胞（图6c）。

04【结论与展望】

1.基于快慢速交换分子组合的超分子水凝胶与合成的ECM替代物的功能性相同，适用于各种类型细胞培养。

2.这项工作证明分子交换动力学对具有粘附配体超分子水凝胶的重要性。作者指出，粘附配体在动态超分子水凝胶中是无效的，但抑制交换动力学会使这些材料具有细胞粘附性。

3.在优化水凝胶的动态特性后，粘附配体的束缚可以驱动细胞粘附和扩散，以及多细胞球体和类器官中的细胞-基质相互作用。

4.该策略为其他按需功能化水凝胶提供了巨大的优势，例如应力松弛，这对于指导细胞行为很重要。

5.该策略将生物化学信号连接到超分子水凝胶中，从而能够调节信号通路并调节细胞增殖和分化。