用单片硅胶柱和LC-MS分析各种食品样品中的人工色素

这项工作描述了一种简单、灵敏的高效液相色谱法和紫外或质谱检测，用于分析各种食品样品中偶氮或邻苯二甲酮等染料类的人工着色剂。经过简短的样品制备程序后，所有样品通过梯度洗脱剖面在C18反相整体式硅胶柱上分离，并直接转移到UV或MS中，以分析主要成分。这种设置可以在极短的分析时间内，通过最小化的样品制备步骤，识别真实样品（如饮料或糖果）中的染料。

19世纪，硫化汞、氧化铅、铜盐或品红等化学物质被用于奶酪、糖果、泡菜[1]或葡萄酒[2]等食品的人工着色。在那个世纪末，许多合成有机食品着色剂的发现使得颜色比传统的天然染料更加鲜艳。这种新物质类别中的一大类是偶氮染料家族，它们是现存最危险的着色剂之一。很明显，大约150年前，营养是危险的。

虽然从19世纪末开始，食品法禁止含有重金属的食品添加剂，但偶氮染料不在该法案的范围内。因此，它们仍然被用于奶酪的着色，例如二甲基苯胺偶氮苯[3]。

从那时起，许多着色剂被禁止使用。这包括一组黄色到红色的偶氮染料食品着色剂（例如“苏丹”、“对位红”），它们具有高度疏水性，因此不溶于水。它们在体内被降解为致癌胺，自1995年以来在欧盟被禁止使用。然而，它们仍然存在于辣椒粉、姜黄或棕榈油等样品以及含番茄的食品中，因此有必要进行快速可靠的鉴定。

如今，欧盟允许在食品中使用大约45种着色剂。其中六种是金属、金属氧化物或金属盐，如氧化铁、金或碳酸钙，另外23种是天然来源的（例如黑莓中的花青素、番茄或辣椒中的类胡萝卜素、甜菜中的甜菜素）或基于天然化合物的（“半合成”，例如藻类中的叶绿素或焦糖色素）。所有其他着色剂均为合成着色剂，主要属于偶氮化合物的物质类别（见表1、表2和图1）。在各种食品和饮料中，它们被用作单一色素成分或与其他着色剂的混合物。所有列出的染料都是无毒和水溶性的，因此很容易被生物体排出体外。

目前大多数人工着色剂现在可以很容易地被天然染料取代。然而，出于经济原因，它们仍然被用来提高糖果或软饮料对儿童的吸引力，或酒精饮料对青少年的吸引力。由于怀疑某些着色剂（例如E102、E110和E129）会影响儿童的活动和注意力，或导致过敏，因此现在欧盟所有含有特定染料的食品都必须相应地贴上标签。

选择三种饮料和一种零食作为样品，利用联用LC-MS技术对人工食品着色剂进行分析。在分析之前，尽可能快速简单地进行样品制备程序。该步骤主要用于去除未溶解物质。在这里，所采用的坚固的整体式硅胶柱技术使更繁琐的方法变得不必要，因为大洗脱液传输孔的固有柱特征将柱堵塞降至最低。目标分析物通过短HPLC梯度运行从复合亲水基质（糖和添加剂，如人造甜味剂、防腐剂和酸化剂）中分离出来，并使用质谱法进行检测。

在这项工作中，提出了几种简单的方法来分析各种食品样品。利用坚固的单片硅胶柱技术，无需复杂的样品制备即可快速检测染料。

实验

材料和方法

所使用的HPLC系统为Dionex Ultimate 3000（美国加利福尼亚州森尼维尔的Thermo Scientific Dionex Corporation），包括Chromolith®FastGradient RP-18端盖50 x 2mm分析整体硅胶柱和Chromolich®RP-18端盖5 x 2mm保护柱（均为德国达姆施塔特的默克Millipore）。根据分析物的不同，紫外检测器在416、480或500 nm处工作。使用Chromeleon软件进行数据采集。

在140-850的m/z范围扫描中使用了带有离子阱和在线电喷雾电离（ESI）源的Bruker Esquire 6000质谱仪（以负模式操作）（取决于着色剂类型）。干燥气体的流量和温度分别设置为12 L/min和365°C，雾化器气体压力为2.8*105 Pa。捕集条件：最大采集时间100 ms，目标值200.000，平均值：2。

样品制备

所有食品样本均在超市购买。有关样品制备或强化的详细信息，请参阅以下不同部分。

着色剂储备溶液

使用胭脂红A（E124）或喹啉黄WS（E104）作为单一成分对几个样品进行了加标。用水作为溶剂的储备溶液中染料的浓度为79.3 mg/L（E104）和1388.8 mg/L（EI24），用于确保所用ESI/MS方法具有足够的灵敏度。

朗姆酒西瓜酒精饮料

这种酒精饮料是朗姆酒和糖、调味料、酸化剂、防腐剂以及两种红色着色剂苋菜红（E123）和Allura红色AC（E129）等成分的水混合物。在分析之前，唯一的样品制备是使用0.45µm注射器微过滤器（默克-密理博）进行过滤步骤。

意大利开胃酒

使用TurboVap II（Biotage，Uppsala，Sweden）在氮气流（1 bar）下，在40°C下，将10 mL含有Sunset Yellow FCF（E 110）的透明橙色开胃酒加热120分钟，以完全去除乙醇。用水将残留物配制成10 mL，并在注射前使用0.45µm注射器微过滤器过滤。

糖衣鹰嘴豆

最初，样品由四种不同颜色的鹰嘴豆和糖衣组成。其中，含有胭脂红A（E124）、日落黄FCF（E110）和柠檬黄（E102）的红鹰嘴豆（10克）被用杵和臼碾碎。然后通过超声波浴将所有可溶化合物溶解在20 mL水中。最后，使用纸过滤器和注射器滤盘（0.45µm）分两步过滤样品。通过与E124储备溶液以2:1的比例（v/v）混合，对所得红色溶液进行加标。

柠檬水

这个淡黄色且浑浊的样品由糖、柠檬汁、柠檬香料、山梨酸钾、苯甲酸钠和抗坏血酸组成。喹啉黄WS（E104）用作食用染料。使用0.45µm注射器微过滤器通过过滤进行样品制备。通过将柠檬水和E104储备溶液以20:1的比例（v/v）混合来进行加标。

结果和讨论

朗姆西瓜酒精饮料样品是在西班牙一家超市购买的，在那里可以买到各种颜色的酒精饮料，从红色到粉红色、黄色、绿色和蓝色不等。在简单检查了配料清单后，作者选择了一个红色的瓶子，因为与其他饮料相比，这种酒精饮料不仅含有一种而且含有两种人造红色着色剂（苋菜红和Allura红AC）。再看一下配料，就会发现这种饮料与西瓜唯一的共同点是它的名字印在瓶子上。图2显示了该样品的LC-UV和LC-MS数据。选择500nm的采集波长作为折衷方案，以检测接近其最大吸收值的两种着色剂，而基质组分不显示紫外线吸收。两种着色剂的MS光谱（见图3）表明，大约三分钟的分析时间足以将两种化合物从基质成分（蔗糖、柠檬酸）中分离出来，基质成分主要在空隙中洗脱。随后，通过进行长期稳定性测试（数据未显示），证明了该色谱柱的高鲁棒性。经过8000多次注射后，得到的分离效果仍然很好，符合图2中显示的色谱数据。

第二个样品是一种著名的意大利开胃酒，采用偶氮化合物日落黄FCF作为染料，颜色为深橙色（见图4中的色谱图）。通过应用快速梯度，染料峰与所有基体成分很好地分离。此外，通过质谱鉴定出奎宁的一个峰，奎宁被用作一种口味添加剂。与酒精饮料相比，质谱数据显示了大约2.5到5分钟范围内的其他未指定峰，这可能是由用于调味的草药消化物中的化合物引起的。

图5显示了糖衣鹰嘴豆分析的色谱图。这种糖果有四种不同的颜色（红色、橙色、黄色和白色），其中一种是用红糖覆盖的鹰嘴豆进行分析。制造商使用胭脂红A进行着色，并对其进行了加标，然而，在紫外和质谱检测中，从橙色和黄色糖衣中提取的少量两种黄色染料Tartrazine和Sunset yellow FCF也被视为“污染物”。如前所示，MS允许识别大量基质成分，而这些成分在紫外线检测中是不可见的。为了提高分析柱的使用寿命，在这种分离中使用了一个5x2mm的整体式硅胶保护柱。正如饮料分析所示，鹰嘴豆的样品制备程序尽可能简短。尽管样品很复杂，含有脂肪、蛋白质和碳水化合物，但目标分析物从基质中很好地分离出来，并得到了明确的鉴定。

最后一个要分析的样品是柠檬水。据制造商介绍，柠檬水中含有10%的天然柠檬汁。然而，其他90%的成分与天然柠檬水没有任何共同之处。其中包括：糖、柠檬味、山梨酸钾、苯甲酸钠、抗坏血酸和喹啉黄WS。图6显示了未着色和着色剂添加样品的UV和MS数据。制造商使用了含有少量单钠形式的染料的二钠盐，对于前者，实现了两种异构体的基线分离。加标溶液主要由喹啉黄WS的单钠盐组成，在色谱图上显示出双峰，保留时间约为4分钟。尽管基质负荷再次很高，但使用快速梯度运行四分钟后，所有成分都被识别出来。

结论

这项工作表明，整体二氧化硅技术与快速简单的样品制备方法相结合，是一个非常适合复杂食品分析的稳健系统。通过样品制备过程去除基质成分，如碳水化合物、脂肪、蛋白质或防腐剂和酸化剂，或通过适当且快速的梯度运行将其从着色剂中分离出来。然后，使用UV或MS很容易识别人工着色剂。根据基质负荷，使用保护柱来保护分析柱。