薯条和香肠中的健康脂肪？一种提取、消化和分析食品中脂肪的新方法

开发了一种测定食品样品中饱和和不饱和脂肪酸的新方法，如巧克力、奶粉、香肠和薯片。该方法包括在封闭系统中快速温和的微波过程，用于样品制备和使用气相色谱-火焰离子化检测（GC-FID）测定脂肪酸。将分析数据与传统ISO程序生成的相同食品样品的结果进行了比较，并解释了新方法的优点。

介绍

欧洲议会第1169/2011号法规（EU）要求详细声明截至2016年的食品营养价值，特别是饱和和不饱和脂肪酸中脂肪的区别[1]。为了保护消费者，这种差异化很重要。例如，美国饮食协会（ADA）、欧洲食品安全局（EFSA）和美国营养与饮食学会（Academy of Nutrition and Dietetics）建议，脂肪占人体每日能量需求的比例不到35%；根据ADA，单不饱和脂肪酸（MUFA）应少于20%。

使用基于ISO标准的方法测定食品中的总脂肪含量以及不饱和和饱和脂肪酸。根据食物的类型，使用Röse-Gottlieb或Weibull-Stoldt提取等方法测定总脂肪含量[2,3]。

使用气相色谱法（GC-FID）对饱和和不饱和脂肪酸进行以下分析。该分析要求根据ISO规范[4]衍生脂肪酸甲酯（FAME）中的脂肪酸。

不饱和脂肪酸对与空气接触产生的氧化过程和热的影响很敏感。这就是为什么开发了一种温和的微波工艺，该工艺分两步在封闭系统中应用于不同的食物隔间。这种新的微波程序比传统的ISO程序更快、更便宜、更环保。

假设在微波过程中，对氧化敏感的不饱和脂肪酸处理得更温和，从而将氧化降至最低，导致不饱和脂肪的分析水平更高

脂肪酸

方法

常规ISO程序：

传统标准程序基于ISO提取法（ISO 8262），用于根据Weibull-Berntrop测定乳和乳制品中的总脂肪，以及基于ISO方法（DIN EN ISO 12966-2）衍生脂肪酸甲酯（FAME）中的脂肪酸。

ISO 8262方法作为基础，与Weibull-Stoldt的提取方法相关联，用于测定食品样品中的总脂肪含量。

Weibull-Stoldt称，ISO提取方法基于盐酸和水的皂化消化，这会释放食物样品中结合蛋白质的脂肪。在接下来的热过滤中，释放的脂肪仍留在过滤器中。将含有脂肪的过滤器清洗至中性，然后干燥。最后，用适当的溶剂在索氏提取器中提取脂肪，需要几个小时。萃取完成后，立即使用旋转蒸发器除去溶剂，并干燥剩余溶剂。通过称量干脂肪来测定总脂肪。

根据GC分析样品制备的ISO程序，脂肪酸甲酯（FAME）中脂肪酸的转化需要在

无水甲醇环境

碱性衍生化从作为甘油三酯结合的脂肪酸和游离脂肪酸的皂化中生成脂肪酸甲酯。以下酸性衍生化最终转移FAME中剩余的皂化脂肪酸。

反应方程式如图1和图2所示。

微波程序：

已为微波系统Discover SP-X®（CEM，Kamp Lintfort）开发了用于测定脂肪的新微波程序。它由微波萃取法（MEM）和微波衍生法（MDM）组成。

MEM是基于Weibull-Stoldt方法开发的，在规定的条件下，同时使用微波辐射在封闭系统中提取食品样品中的总脂肪。

在封闭系统（包括MDM）中，在微波辐射下对提取的脂肪酸进行衍生化。脂肪酸甲酯（FAME）中脂肪酸的转化还需要在无水甲醇环境中进行一系列碱性和酸性衍生，以便随后进行GC分析。

GC分析：

使用气相色谱仪对食品样品的FAME进行了分析

GC-2010 Plus AF，带FID检测器（Shimadzu Europa GmbH，德国杜伊斯堡）。

Influence of the method of sample preparation and derivatisation on the content of unsaturated fatty acids in the total fat content of food samples needs to be investigated. In order to compare the contents of unsaturated and saturated fatty acids in both methods, the total amounts of all fatty acid peak areas are calculated (= 100%). Peak areas of unsaturated and saturated fatty acids are then summarised, and the ratio of unsaturated vs. saturated fatty acids is calculated. This procedure has been applied for both the ISO procedure and the microwave procedure.

实验部分

ISO程序：

提取方法：

在600 mL玻璃烧杯中称量食物样品，预计脂肪总重量为2至3 g。用100 mL水和150 mL盐酸（25重量%）处理样品。

用玻璃盖盖住玻璃烧杯，然后将样品煮沸30至60分钟。消化过程结束后，用100 mL水稀释热样品，并在热水之前用润湿的2层圆形过滤器中过滤。然后，用热水用中性水清洗过滤器和残留物。最后，将滤纸和残渣在105°C的烘箱中干燥一小时。然后将干燥的过滤器转移到萃取套筒中，并最终放置在250 mL提取器（索氏仪器）中。

在索氏仪器的圆底烧瓶（250 mL）中填充溶剂，溶剂的体积相当于索氏仪器体积的1.5倍。溶剂汽油醚的温度为40–60°C。然后设置回流冷凝器，煮沸溶剂，并在3-6小时内提取脂肪。萃取后，剩余液体在旋转蒸发器中完全蒸发。然后，在105°C下将打开的烧瓶进一步干燥1小时，以完全去除萃取液。冷却后，称量烧瓶并测定总脂肪含量。

基于ISO的脂肪酸衍生用于GC分析：

将提取的脂肪转移到10 mL圆烧瓶中，并用2 mL（0.2 mole/L）甲醇钠甲醇溶液处理（8 g氢氧化钠溶于1000 mL甲醇中）。在回流下煮沸，直到溶液澄清（5至20分钟）。煮沸时间取决于脂肪酸的链长，脂肪酸越长，煮沸时间越长。然后，将烧瓶从热源中取出，并加入两滴酚酞溶液。

然后在甲醇溶液中添加硫酸（1摩尔/升），直到溶液澄清；然后再添加0.2 mL。重新安装冷却器，将溶液回流煮沸5分钟。溶液再次从热源中取出，并在水中冷却。现在添加4 mL饱和氯化钠溶液并摇匀。然后，添加1mL正己烷，再次摇晃烧瓶15秒。溶液静置，直到两个相分离。再次添加饱和氯化钠溶液，直到水相达到烧瓶颈的下液位，约2–3 mL。上相现在含有生成的FAME。

微波法：

提取方法：

在80 mL玻璃瓶中称量0.5 g样品，并用3.5 mL盐酸（37重量%）、7.5 mL水和5 mL正己烷处理。添加搅拌器芯片。Discover SP-X®上设置了以下参数。

最终温度：115°C

斜坡：4分钟

搅拌器：强劲

保持时间：15分钟

功率：200瓦

消化和提取后，将溶剂转移到先前称重的铝碗中，以便进行冷提取。用5 mL正己烷再次处理小瓶中的消化物，然后在磁力搅拌器上搅拌1分钟。然后，该溶剂将被转移到铝碗中。这种冷提取重复三到四次。将含有提取脂肪的溶剂在105°C的加热炉中干燥20分钟，最后称量碗。总脂肪含量的计算方法如下式1所示：

方程式1

m2 = Mass in g empty bowl

m1 = Mass in g bowl with dried fat

E = Mass in g weight sample

对于衍生化（MDM），在玻璃瓶中用10 mL无水甲醇氢氧化钾溶液（2.5重量%）处理一滴或两滴干燥脂肪，并添加搅拌芯片。

碱性衍生化需要Discover SP-X®上的以下参数

最终温度：90°C

斜坡：5分钟

保持时间：10分钟

搅拌器：中等

功率：200瓦

完成碱性衍生化后，在水浴中冷却小瓶。添加14.25 mL甲醇和0.75 mL盐酸（37重量%），并在Discover SP-X®上使用以下参数生成酸性衍生物

最终温度：120°C

斜坡：5分钟

保持时间：6分钟

搅拌器：中等

功率：200瓦

完成衍生化后，在水浴中冷却小瓶。添加10mL正己烷，将小瓶从下往上转动两次。

必须避免产生超压。然后用饱和氯化钠溶液填充玻璃瓶直至顶部。需要用移液管将溶剂转移到10 mL GC小瓶中，包括硫酸钠或硫酸镁作为干燥剂（约0.2 g），以检测可能的水残留。此解决方案现在可以使用GC-FID分析FAME。

GC分析：

为了识别和量化FAME，使用37标准混合液（Supelco），并在GC-2010 Plus AF上使用FID检测器进行分析。

GC上设置了以下参数：

喷油器：SPL（分体式1:100）

进样量：1µL

喷油器温度：250°C

列类型：FAME WAX

内径：0.25mm

膜厚：0.25µm

探测器温度：250°C

流动相：氦

载气速度：35厘米/秒

温度程序在130°C时启动，保持时间为一分钟。然后，继续加热，加热速度为

5°C/分钟直到达到温度

240°C，然后保持恒定10分钟。总时间为33分钟。

结果和讨论

采用火焰离子化检测的气相色谱法对几乎所有脂肪酸衍生物FAME的分离进行了优化。

从标准混合物中包含的37种脂肪酸中，已鉴定出36种脂肪酸。两种脂肪酸C18:1-顺式和C18:1-反式无法分离，因为它们是共洗脱的。但这对饱和和不饱和脂肪酸的评估和区分没有影响，因为这两种共洗脱脂肪酸都是不饱和的。

图4显示了香肠样品的色谱图，其中含有根据ISO程序生成的已识别FAME。显然，脂肪酸C16:0和C18:0主要存在。

与ISO程序的结果相比，图5显示了使用微波程序的相同样品的色谱图。

色谱图的比较（图4和图5）显示了FAME的显著差异。与ISO程序相比，微波程序对C18:1-顺式顺式的结果显著更高。

表1显示，ISO方法的结果与微波方法相比有显著差异。为了进行更精确的比较，图1中使用了饱和和不饱和脂肪酸的峰面积，显示了ISO法和微波法在香肠样品上脂肪酸比率的差异。

两种方法的比较表明，微波法测定不饱和脂肪酸的结果比ISO法高10倍。如图2所示，在测定奶粉、巧克力和薯片等其他食品样品时，可以以相同的方式观察到这些不饱和脂肪酸的升高结果。

在所有测定的食品样品中，使用微波程序产生了更多的不饱和脂肪酸。这证实了一个假设，即新的微波程序可以防止不饱和脂肪酸在该过程中氧化，而使用新的微波过程时，温和的处理会产生更高的结果。

食物样品中总脂肪浓度的差异在19.66%到37%之间，这也导致了不饱和脂肪酸的差异。当产品新鲜时，薯片中的不饱和脂肪酸含量最初处于最高水平。一旦氧化过程开始（打开塑料袋后），不饱和酸的含量就会发生变化。

结论

食品样品的申报越来越复杂。对于消费者来说，声明非常重要，因此需要一定的透明度。欧盟第1169/2011号法规要求详细申报食品样本。最重要的是区分饱和和不饱和脂肪酸中的总脂肪，这是消费者区分健康食品和不健康食品的最高标准，这也是两项研究的主题。ISO规范规定了总脂肪含量以及不饱和和饱和脂肪酸的测定。

在这项工作中，开发了两种方法。第一种方法是基于Weibull-Stoldt方法，在封闭微波系统中消化和提取总脂肪含量的程序。选择了不同地区的食品样品（乳制品、奢侈食品、肉类和糕点），并评估了微波法在封闭系统中测定总脂肪的应用。它被认为是测定不同食物区域总脂肪含量的通用方法。

第二种方法对应于微波法，也是在一个封闭系统中衍生FAME中的脂肪酸，然后在GC-FID系统中进行分析。使用开发的微波提取方法表明，该方法最适合于测定食品样品的总脂肪含量。

在第二种方法中，对食品样品进行了37种不同脂肪酸甲酯的分析。这使得能够比较消化和提取食品样品总脂肪含量的DIN方法与衍生FAME中提取脂肪酸的ISO方法，以及由微波提取法（MEM）和微波衍生法（MDM）组成的微波程序。

这一比较的重点是饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸（奶粉、巧克力、香肠、薯条）之间的比率。结果表明，ISO法和微波法的脂肪酸比例不同。当使用微波程序时，不饱和脂肪酸的比例始终较高。

较高的不饱和脂肪酸发现率证实了不饱和脂肪酸类对空气氧化和热影响的敏感性。

DIN程序是一个开放系统，需要长时间加热，这会影响不饱和脂肪酸（氧化）。微波系统是一个封闭系统，加热时间显著缩短，不饱和脂肪酸的氧化减少。因此，就不饱和脂肪酸而言，微波法是一种更温和、更可取的方法。